Histologia Básica, Texto e Atlas - 12ª Edição - Junqueira & Carneiro

1 1 Métodos de Estudo em Histologia
A B
e D
Uma das exigências mais importantes da imunocitoqufmica
é a disponibilidade de um anticorpo contra a proteina
que se pretende detectar. Isso significa que a proteína deve
ter sido previamente purificada e isolada de modo que anticorpos
possam ser produzidos contra ela
Anticorpos monodonais e polidonais
Suponhamos que se queira produzir anticorpos contra
a proteína X de uma determinada espécie animal (um
rato, um hlm1ano). Se X já está isolada, ela é injetada em
outra espécie (um coelho, uma cabra). Se a proteína for
suficientemente diferente para este animal reconhecê-la
corno estranha, o animal produzirá anticorpos contra a
proteína (anticorpo de coelho contra protema X de rato ou
anticorpo de cabra contra proteína X humana). Esses anticorpos
são coletados do plasma do animal e usados para
imunocitoquúnica.
f Para saber mais
•
Figura 1.19 Substânciasquetêmgrandeafinidadeporuma moléCIJ!apodemsermarcadas
e usadas para identificar esta molêwla. A. A molêwla o
tem uma afinidade intensa e
espedfica por uma porção da molécula b. B. Se a e b Ião colocadasemcontato,ase liga com
a porção de bque ela reconhece. C. Um marcador, visível em microscopia de luz ou eletrônica,
pode ser ligado a molécula a. O marcador pode ser um composto fluorescente, uma enzima
como a peroxidase, uma partícula de ouro ou um átomo radioativo. D. A molécula b pode
ser detectada se existir em uma célula ou na matriz extracelular após incubação em uma
solução que contém a molécula a.
glicoprotefnas, proteoglicanos e glicolipídios e são muito
usadas para caracterizar moléculas de membranas celulares
que contêm sequências específicas de aç1kares.
• lmunocitoquímica
Um tipo de interação altamente específica entre moléculas
é aquela que ocorre entre uma molécula e um anticorpo
que a reconhece. Por essa razão, métodos que usam anticorpos
são de grande utilidade para identificar e localizar
proteínas e glicoproteínas. A imm1ocitoquímica é a meto·
dologia que possibilita identificar, por meio de anticorpos,
moléculas em cortes ou em células cultivadas.
Em uma reação imunocitoqlúmica, células em cultura
ou um corte de tecido que se supõe conter uma determi-
11ada proteína são incubados em uma solução que contém
um anticorpo que reconhece essa proteína. Como o anticorpo
não é visível por microscopia, suas moléculas devem
ser inicialmente acopladas a um marcador. O anticorpo
se liga especificamente à proteú1a e sua localização pode
então ser evidenciada por microscopia de luz ou eletrônica,
dependendo do marcador que foi acoplado ao anticorpo.
Técnicas de imunocitoquímica
Há fundamentalmente duas técnicas usadas em ímunocitoquímica:
• Técruca direta de imunocitoquímica: nesta técnica, o anticorpo
(monoclonal ou pollclonal) contra a proteína X é ligado a um marcador
apropriado. Um cone de tecido é incubado com o anticorpo durante
algum tempo, de modo que o anticorpo interage e se liga à proteína X
(Figura 1.20). Em seguida, o cone é lavado para remover o anticorpo
o.lo ligado. O corte pode então ser observado por microscopia de luz
ou eletrônica, dependendo do marcador utilizado (uma substância
fluorescente, uma enzima, panículas de ouro). Se o marcador foi
peroxídase ou outra enzima, o cone deve ser colocado em contato
com o substrato dessa enzima antes de ser analisado (ver Hlstoquf·
míco e cítoqulmica). Os locais do corte que contêm a proteína X ficarão
fl uorescentes, ou serão cobertos por um precipitado escuro ou colorido
em razão da presença da enzima ou de partículas de ouro
• Técmca indireta de lmunocitoquímica: é mais sensível, porém requer
mais etapas na sua execução. Se quisermos detectar uma proteína
X existente em tecidos de ratos, é necessário inicialmente produzir
dois anticorpos diferentes: (1) em um coelho se produzem anticorpos
(monoclonais ou policlonais) contra a proteína X de rato; (2) em um
procedimento paralelo, imunoglobulina de um outro coelho (nonnal,
o.lo imunizado) é injetada em uma terceira espécie (p. ex., uma ovelha
ou uma cabra). lmunoglobulina de coelho é considerada estranha por
ovelhas ou cabras, que respondem produzindo um anticorpo contra
a imunoglobulina - um antianticorpo ou anti-imunoglobullna. Esse
anticorpo é, em seguida, ligado a um marcador adequado.
Na primeira etapa da técnica indireta, um cone de tecido de rato
que se supõe conter a proteína X é incubado inicialmente com anticorpo
de coelho antiproteína X de rato. Depois de lavar os cortes, eles são
incubados com o antianticorpo marcado que reconhecerá e se ligará ao
anticorpo de coelho que se havia ligado à proteina X (Figura 1.21). Em
seguida, o cone é observado ao microscópio de luz ou eletrônico após
tratamento adequado. de.pendendo do marcador utilizado. Apesar de
ser mais complexa, a técnica de imunocitoquímica indireta é mais sensível,
respondendo com um sinal maior que a técnica direta, o que pode
ser observado pela comparação das Figuras 1.20 e 1.21. Há métodos
indiretos que envolvem o uso de outras molé