Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Diskussion
5.1.2 RT-PCR Systeme zum Nachweis von GFAP-mRNA
In dieser Dissertation wurde die mRNA des GFAP nach Extraktion der Gesamt-RNA mittels
RT-PCR nachgewiesen und als Marker für bovines ZNS-Gewebe verwendet (SEYBOLDT et
al. 2003). Die RT-PCR gehört zu den indirekten Nachweismethoden für mRNA (JOHNSTON
et al. 1997). Direkte Methoden zur Detektion von mRNA sind beispielsweise der Northern
Blot oder die in-situ-Hybridisation. Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode, um mRNA
in geringen Konzentrationen über einen längeren Zeitraum zu detektieren (FITZPATRICK et
al. 2001; YASOJIMA et al. 2001).
Es wurden drei verschiedene RT-PCR-Systeme angewandt. Das erste System verwendete die
Oligonukleotidprimer „GFAPforw“ und „GFAPrev“, die an die Exonregionen 3 und 4,
welche das Intron 3 umgeben, binden und ein 168 bp großes Fragment der GFAP-mRNA
amplifizieren. Da die verwendeten Primer jeweils in einem anderen Exonbereich binden, ist
das entstehende 168 bp große GFAP-mRNA Amplifikat spezifisch für die mRNA. Signale,
die von der DNA des GFAP Gens stammen, weisen eine Größe von 957 bp auf (SEYBOLDT
et al. 2003). Somit kann auf eine Kontrolle zur Überprüfung einer möglichen DNA-
Kontamination verzichtet werden. Bei Verwendung dieser RT-PCR konnte ZNS-Gewebe
vom Rind in zerkleinerten Fleisch und in einem pasteurisierten Fleischerzeugnis sicher
detektiert werden (s. Kapitel 2.4.5).
In den hier vorgestellten Untersuchungen zur Detektion von porcinem ZNS-Gewebe in einem
Fleischerzeugnis zeigte sich, dass bei Verwendung der PCR mit den Primern GFAPforw und
GFAPrev die Nachweisgrenze über 5 % Gehirngewebebeimengung lag (s. Kapitel 4.2.2.1).
Hinweise auf eine geringere Nachweisbarkeit porciner GFAP-Sequenzen mit diesen Primern
finden sich auch bei SEYBOLDT et al. (2003). Um an Sequenzinformationen der 168 bp
großen Amplifikate der GFAP-mRNA für die RFLP zu gelangen und um für die Tierart
Schwein sensitivere Primer auswählen zu können, wurde anhand der Sequenzinformationen
der bovinen GFAP-mRNA eine weitere RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2
etabliert. Mit dieser RT-PCR wurde beim Rind ein Sequenzabschnitt der GFAP-mRNA von
399 bp Größe amplifiziert, der weiter in den Bereich der das Intron 3 umschließenden Exons
3 und 4 reichte (Kapitel 4.3, Abb. 7). Diese RT-PCR führte auch bei den Tierarten Schwein /
Wildschwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild und Rotwild zu einem 399bp großen
Amplifikat.
103