Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Wissenschaftliches Schrifttum
vorgeschlagen, bei dem das Gehirn vorsichtig seziert und die Gewebeblöcke in flüssigen
Stickstoff schockgefroren werden. Im gefrorenen Zustand wird die mRNA nicht geschädigt.
So konnte bei einer Lagerung von bis zu 15 Jahren bei – 70°C kein Verlust an mRNA
nachgewiesen werden (BURKE et al. 1991; LEONARD et al. 1993; EASTWOOD et al.
1995; YASOJIMA et al. 2001). Bei bereits gefrorenen Geweben ist mRNA noch 1 – 2
Stunden nach dem Auftauen zuverlässig nachweisbar (YASOJIMA et al. 2001). Das
postmortale Zeitintervall bis zur weiteren Verarbeitung des Gehirngewebes hat nur einen
begrenzten Einfluss auf die mRNA- und Proteinintegrität (TAYLOR et al. 1986; HARRISON
et al. 1995). In einer Studie von TROTTER et al. (2002) hatte die Lagerung von
Gehirngewebe für vier Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Kühlung bei 4°C über
Nacht, kaum Einfluss auf die Stabilität oder Qualität der mRNA. In weiteren Studien konnte
mRNA bei Raumtemperatur bis zu 48 Stunden in humanen Geweben (ARAI et al. 1989;
HARRISON et al. 1997; SCHRAMM et al. 1999; YASOJIMA et al. 2001) und bis zu
96 Stunden in bovinen Geweben des Reproduktionsapparates (FITZPATRICK et al. 2001)
nachgewiesen werden. Bei kühler Lagerung bei 4°C bis zu 96 Stunden ist in humanen
Geweben noch mRNA nachweisbar (YASOJIMA et al. 2001). In zellarmen Geweben, wie
z.B. Knorpel oder Sehnen, konnte mRNA noch bis zu 48 Stunden bei Lagerung unter
Raumtemperatur und bis zu 96 Stunden bei kühler Lagerung (4°C) nachgewiesen werden
(MARCHUK et al. 1998). LUKIW et al. (1990) zeigten in ihrer Studie, dass die mRNA von
HNF-L, GFAP, die eine Klasse von reichlich vorhandenen Proteinen repräsentieren, gefolgt
von α-Tubulin und β-Aktin, postmortem lange Halbwertszeiten (HWZ) haben. Eine andere
Studie zeigte, dass die mRNA von β-Globin eine HWZ von über 50 Stunden hat (STOLLE u.
BENZ 1988). Somit haben besonders gehirnspezifische und zytoskelettspezifische mRNA,
deren Transkripte reichlich in der Zelle vorhanden sind, eine lange HWZ (JOHNSON et al.
1986; LUKIW et al. 1990). mRNA ist somit noch zuverlässig in postmortalem Gehirngewebe
mit langer Autolysezeit nachweisbar, unter der Voraussetzung, dass diese Gewebe noch nicht
vollständig zersetzt sind. Der Nachweis der mRNA kann durch (a) einen spektrometrischen
Assay, (b) in-situ-Hybridisation (WAKER u. MCNICOL 1992), (c) Visualisierung mittels
Gel-Elektrophorese (BAHN et al. 2001), (d) Northernblot (FITZPATRICK et al. 2001;
YASOJIMA et al. 2001) sowie (e) sehr genau durch die RT-PCR und cDNA-Synthese
erfolgen (JOHNSTON et al. 1998; SCHRAMM et al. 1999; FITZPATRICK et al. 2001;
YASOJIMA et al. 2001). Bei der Detektion der mRNA-Signale ist die RT-PCR eine sehr
sensitive Methode, die mRNA noch nach langer Zeit detektieren kann. (FITZPATRICK et al.
2001; YASOJIMA et al. 2001).
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