Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
Versuchen mit Vollkonserven (s. Kapitel 3.2.5.1.4) wurde eine positiv getestete
Rindergehirnprobe mitgeführt. Die nicht zur PCR benötigten Probemengen wurden bis zur
weiteren Verwendung bei – 20°C gelagert.
3.2.3.3 Polymerase Chain Reaktion (PCR)
Durch Polymerase Chain Reaktion (PCR) erfolgte die Amplifikation der c-DNA aus der
reversen Transkription.
3.2.3.3.1 PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev
Die in der PCR eingesetzten Primer GFAPforw und GFAPrev wurden von Seyboldt et al.
(2002) aus Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA (GenBank accession no.
Y08255) entwickelt und binden an Sequenzen der Exons, die das Intron 3 (accession no.
L19867) flankieren. Die Sequenzen der Primer lauten:
• GFAPforw: 5`-GAGGAAGATTGAGTCTCTGGAGGA- 3`
• GFAPrev: 5`-TCATACTGTGTGCGGATCTCTCTC- 3`.
Der Mastermix für die PCR mit GFAPforw und GFAPrev Primern enthielt pro Reaktion
folgende Komponenten (Tabelle 4):
Tabelle 4: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPforw und GFAPrev
Reagenzien Konzentration Volumen (µl)
10 x PCR-Puffer 5
dNTPs je 10 mM/µl 1
GFAPforw 100 pmol/µl 1
GFAPrev 100 pmol/µl 1
Taq-Polymerase 5 U/µl 0,2
DEPC-Wasser 39,8
Die Reagenzien wurden vorgemischt und je 48 µl dieses Gemisches entweder in 0,2 ml
Achterstrips oder 0,2 ml Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert.
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