Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Wissenschaftliches Schrifttum
2.5 Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
Das zur RT-PCR benötigte Enzym reverse Transkriptase, auch Revertase oder
Umkehrtranskriptase genannt, ist eine RNA-abhängige DNA-Poymerase und natürlicher
Bestandteil von Retroviren. Die reverse Transkriptase wird zur Umschreibung von RNA in
komplementäre oder copy-DNA (cDNA) benötigt (NIEMANN 2000).
Die so gebildete cDNA dient als Martize für die nachfolgende Polymerase Kettenreaktion
(PCR). Die PCR wurde von MULLIS et al. (1986) entwickelt. Mittels der PCR kann in-vitro
eine bestimmte DNA- oder RNA-Sequenz amplifiziert werden. Als Startpunkte für die DNA-
Polymerase dienen zwei synthetische Oligonukleotide, die auch Primer genannt werden,
welche die Zielsequenz flankieren und eine möglichst ähnliche Schmelztemperatur haben
sollten (EHRLICH 1996). Die PCR besteht aus einer Folge von mehreren Zyklen. Ein Zyklus
besteht aus drei Schritten. Zunächst wird die Zielsequenz durch Erwärmung denaturiert.
Danach binden die Oligonukleotidprimer an die so gebildeten Einzelstränge der DNA
(Annealing). Zuletzt werden bei der Extension durch die Polymerase die zur DNA-Matrize
komplementären Nukleotide an die freie 3´-Hydroxylgruppe der Oligonukleotidprimer
angehängt. So werden die Oligonukleotidprimer komplementär zur DNA-Matrize verlängert.
Der neu gebildete DNA-Strang kann im nächsten Zyklus als Vorlage dienen. Durch die
ständige Wiederholung der Zyklen kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der
Zielsequenz, solange die Einzelkomponenten frei verfügbar sind. Wenn die
Einzelkomponenten verbraucht sind, flacht die Kurve der Vermehrung ab und es stellt sich
ein Gleichgewicht zwischen DNA-Denaturierung sowie Neubildung der Zielsequenz ein
(EHRLICH 1996).
Die RT-PCR ist eine sehr sensitive Methode, um mRNA zu detektieren (CHEN et al. 1999;
SCHRAMM et al. 1999). Die Sensitivität der Methode wird zum einen durch die Auswahl der
Primer bestimmt (SAIR et al. 2002) und zum anderen können Inhibitoren die Sensitivität der
RT-PCR beeinflussen (SAIR et al. 2002). Bei dem Nachweis von Viren in Lebensmitteln
mittels RT-PCR wurden bereits viele Methoden, die den Einfluss von Inhibitoren
berücksichtigen, untersucht (DREBOT u. LEE 1997; AGGARWAL u. MCCAUSTLAND
1998; SHIEH et al. 1999; KOK et al. 2000; SAIR et al. 2002).
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