Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Diskussion
5.4 RFLP des 168 bp GFAP-mRNA Fragmentes zur Identifizierung
boviner GFAP-mRNA
In den hier vorgestellten Untersuchungen wurde im Anschluss an die RT-PCR ein RFLP
durchgeführt, um neben dem Nachweis der GFAP-mRNA eine Differenzierung der Tierarten
zu erlangen. Nach dem derzeitigen Wissensstand ist die PCR-RFLP einer konservierten
Region der DNA, wie z.B. des Cytochrom b Gens, eine gut erforschte Methode, um
verschiedene Spezies in Fleischerzeugnissen zu detektieren (MEYER et al. 1995) sowie
zwischen eng verwandten, verschiednen Rotwildspezies (WOLF et al. 1999) und Fischspezies
(CÈSPEDES et al. 1998; BELLAGAMBA et al. 2001; QUINTEIRO et al. 2001) zu
unterscheiden.
In dieser Arbeit konnte mit den Primern GFAPforw und GFAPrev die GFAP-mRNA aus
ZNS-Gewebe der Tierarten Schwein, Wildschwein, Rind, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild
und Rotwild detektiert werden (s. Kapitel 4.3, 4.4). Aufgrund der durchgeführten Versuche
zur Gewebespezifität ist bisher nur die bovine GFAP-mRNA ein sicherer Marker für ZNS-
Gewebe. Deshalb muss, bei einem positiven Nachweis von GFAP-mRNA, durch die
Amplifikation eines 168 bp großen Fragments der GFAP-mRNA Sequenz, die bovine
Herkunft dieses Signals verifiziert werden. Nur wenn dies gelingt, ist bovines ZNS-Gewebe
nachgewiesen.
In vorangegangenen Untersuchungen zur Differenzierung boviner GFAP-mRNA
(SEYBOLDT et al. 2003), wurden die Restriktionsenzyme Hae III und Sst I verwendet.
Aufgrund fehlender Sequenzdaten der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild, Rehwild
und Rotwild, war jedoch die Unterscheidung Damwild / Rind problematisch. Durch die
Entwicklung der RT-PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2 und die anschließende
Sequenzierung der erhaltenen Amplifikate konnten die notwendigen Sequenzinformation zum
entsprechenden GFAP-mRNA Abschnitt der Tierarten Schwein, Schaf, Pferd, Damwild,
Rehwild und Rotwild erarbeitet werden (s. Kapitel 4.3).
Anhand der erhaltenen Sequenzdaten konnten nun die Fragmentgrößen nach
Restriktionsenzymspaltung für die untersuchten Tierarten berechnet werden (s. Kapitel 4.3,
Abb. 8) und zur Differenzierung von boviner GFAP-mRNA geeignete Restriktionsenzyme
ausgewählt werden. Die bei der Restriktionsenzymanalyse entstehenden Fragmentmuster
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