Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
3.2.3.4 Reinigung von DNA für die nachfolgende Sequenzierung
Die in Kapitel 3.2.3.3.2 gewonnenen 399 bp großen Amplifikationsprodukte der GFAP
mRNA wurden in einem nächsten Schritt aufgereinigt, um sie anschließend bei der
Sequenzanalyse verwenden zu können. Verwendet wurde das QIAquick ® PCR-Purification
Kit (Qiagen GmbH, Hilden). Das Arbeitsprotokoll wurde nach Herstellerangaben
durchgeführt. Hierzu wurde zunächst der PE-Puffer mit 96 %igen Ethanol versetzt. Dann
wurden 5 Teile des PB-Puffers mit 1 Teil des PCR-Produktes vermischt. Als nächstes wurde
die so erhaltene Lösung auf die QIAquick ® Mini-Säule gegeben und 1 Minute bei 10000 x g
zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, die Säule anschließend mit 750 µl PE-Puffer
beschickt und wiederum 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Dabei wurden Primer bis 40 bp
und Salze entfernt, die im Durchfluss, der wieder verworfen wurde, enthalten waren. Danach
wurde die Säule nochmals für 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Nachfolgend wurde die
Säule auf ein neues 1,5 ml RNase und DNase freies Reaktionsgefäß gesetzt, 50 µl EB-Puffer
auf die Säulenmembran gegeben und nochmals 1 Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Das
hierbei entstandene Eluat enthielt die gereinigte DNA. Von dieser DNA-Lösung wurde ein
Aliquot zur Sequenzanalyse in das Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der
Tierärztlichen Hochschule Hannover gegeben. Dort wurde eine Sequenzanalyse nach dem
Didesoxynukleotidverfahren von SANGER et al. (1977) durchgeführt.
3.2.3.5 Gelelektrophorese
Für die Herstellung der Agarosegele wurden 7,5 g (für ein 2,5-%iges Gel) bzw. 11,25 g (für
ein 3,75-%iges Gel) Agarose abgewogen und zusammen mit 300 ml 1 x TBE-Puffer in einem
600 ml Becherglas 30 Minuten bei 200°C auf einem Magnet-Heizrührer erwärmt, so dass sich
die Agarose in dem TBE-Puffer löste. Anschließend wurde die Lösung bei 300°C auf dem
Magnet-Heizrührer kurz aufgekocht und nachfolgend auf einem weiteren Magnetrührer für
ca. 30 Minuten auf eine Temperatur von ca. 50 – 60°C abgekühlt. Danach wurden 3 – 4 µl
Ethidiumbromid je 100 ml Agarosegel zugegeben und die Flüssigkeit in eine vorbreitete
Gelgießeinrichtung verbracht. Nach einer Abkühlungsphase von ca. 30 Minuten war das
Agarosegel erstarrt und die Kämme wurden entfernt.
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