Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
Bei Gebrauch wurde das Agarosegel in eine Elektrophoresekammer mit 1 x TBE-Puffer als
Laufpuffer verbracht. 8 µl Probe wurden mit 2 µl Blaumarker vermengt und auf das
Agarosegel in die Geltaschen aufgetragen. Als Längenstandard diente puC 19/Msp I, der in
die jeweils erste und letzte Geltasche aufgetragen wurde. Es folgte der Lauf der DNA im Gel
bei 200 Volt über 30 Minuten und damit die Auftrennung der DNA anhand ihrer Größe. Auf
einem Transilluminator mit 254 nm UV-Licht erfolgte die Auswertung des Gels. Die
Dokumentation der Ergebnisse fand durch Fotografieren mit einer Polaroid-Kamera statt.
Eine Probe wurde dann als positiv für das Vorhandensein von GFAP-mRNA bewertet, wenn
die Bande ein Fragment mit der Größe von 168 bp bzw. 399 bp aufwies. Eine Bande mit
einem Fragment der Größe von 957 bp zeigt das Amplifikationsprodukt der genomischen
DNA.
3.2.3.6 Untersuchungen zur Tierartspezifität des GFAP-mRNA-Nachweises
Bei dem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) wurde die zu untersuchende
DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, und mittels Gelelektrophorese
aufgetrennt. Dazu wurden die PCR-Produkte aus den Versuchen mit Gehirngewebe der
Tierarten Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Wildschwein, Dammwild, Rehwild, Rotwild, Huhn
und Pute verwendet. Zunächst wurden 10 µl der unverdauten PCR-Probe mittels
Gelelektrophorese (Kapitel 3.2.3.5) auf das Vorhandensein des 168 bp großen GFAP-mRNA
Fragments untersucht und darauf geachtet, dass diese Proben frei von dem 957 bp großen
DNA-Fragment waren. Als nächstes wurden die Restriktionsenzyme (Tabelle 9) in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß vorgegeben und mit 10 µl des jeweiligen PCR-Produktes durch vorsichtiges
auf- und abpipettieren gründlich vermengt. Danach wurden die so vorbereiteten
Reaktionsgefäße für 60 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert und die Proben
nachfolgend mittels Gelelektrophorese auf das Vorhandensein des jeweiligen
Spaltungsmusters untersucht.
Die verwendeten Restriktionsenzyme und ihre eingesetzte Konzentration sind der
nachfolgenden Tabelle zu entnehmen (Tabelle 9):
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