Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
des Ethanols erneut gewaschen. Das so erhaltene RNA-Pellet wurde bei 60°C im Heizblock
für ca. 30 Sekunden getrocknet, in 100 µl DEPC-behandelten Wasser gelöst, in 1,5 ml
Reaktionsgefäße überführt und anschließend bei – 20°C gelagert.
3.2.3.2 Reverse Transkription
Die c-DNA-Synthese wurde mit der Superscript II RT (Invitrogen TM life technologies,
Karlsruhe) in zwei Schritten nach Herstellerangaben durchgeführt.
Für den Primermix wurden pro Reaktion
• 2 µl Random-Hexamere (≅ 200 ng),
• 2 µl DNase und Rnase-freies Wasser (DEPC-behandelt),
• 1 µl dNTP-Mix,
in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgemischt und anschließend mit 5 µl der aus der RNA-
Extraktion gewonnenen Probe in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß (Mµlti ® -Ultra Tubes)
vermischt. Dann wurden die Proben in einen Thermocycler verbracht und für 5 Minuten bei
65°C erwärmt. Dabei wurden die Sekundärstrukturen der RNA zerstört. Anschließend wurden
die Proben bis zur Entnahme aus dem Thermocycler für mindestens eine Minute auf 4°C
heruntergekühlt.
Nachfolgend wurde in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß der Reaktionsmix angesetzt, der pro
Reaktion folgendes enthielt:
• 4 µl 25 mM MgCl 2
• 2 µl 10 x RT-Puffer
• 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT)
• 1 µl RNase OUT TM .
9 µl des Reaktionsmixes wurden zu dem Primermix in die 0,2 ml Reaktionsgefäße
hinzupipettiert und das Gemisch anschließend im Thermocycler für 2 Minuten bei 25°C
inkubiert. Nachfolgend wurde 1 µl Superscript II RT TM mit der Konzentration von 50 U/µl
hinzupipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden dann im Thermocycler folgendem Temperatur-
Zeit-Profil unterzogen:
10 min bei 25°C, 50 min bei 42°C, 15 min bei 70°C und 4°C bis zur Entnahme der Probe aus
dem Thermocycler (mindestens 1 Minute). Als Negativkontrolle wurde eine Reaktion,
bestehend aus Primermix und Reaktionsmix, mitgeführt. Als Positivkontrolle bei den
48