Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
3.2.3.3.3 PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2
Die hierbei verwendeten Primer wurden mittels der Sequenzinformationen des 399 bp großen
Fragmentes der porcinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. AJ551395) entwickelt. Die
Primer amplifizieren ein 168 bp großes Fragment der porcinen GFAPmRNA.
Die Sequenz der Primer lautet wie folgt:
• GFAPpork1: 5` -GAGGAAGATCGAGTCTTTGGAGGA- 3`
• GFAPpork2: 5` -TCATATTGCGTGCGAATCTCTCTC- 3`
Für die PCR mit GFAPpork1 und GFAPpork2 Primern enthielt der Mastermix pro Reaktion
folgende Komponenten (Tabelle 8):
Tabelle 8: Mastermix für PCR mit den Primern GFAPpork1 und GFAPpork2
Reagenzien Konzentration Volumen (µl)
10 x PCR-Puffer 5
dNTPs je 10 mM/µl 1
GFAPpork1 50 pmol/µl 1
GFAPpork2 50 pmol/µl 1
Taq-Polymerase 5 U/µl 0,2
DEPC-Wasser 39,8
Von den vorgemischten Reagenzien wurden je 48 µl entweder in 0,2 ml Achterstrips oder in
0,2 ml Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert und mit 2 µl der jeweiligen c-
DNA-Proben, einschließlich der mitgeführten RT-Negativkontrolle, vermischt. Es wurde eine
PCR-Negativkontrolle, sowie eine PCR-Positivkontrolle, bestehend aus Schweine-DNA,
mitgeführt. Dann wurden die Reaktionsgefäße gut verschlossen in den Thermocycler
überführt und dem Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern GFAPforw und
GFAPrev unterzogen (Tabelle 5).
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