Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
Tabelle 6: Mastermix für PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2
Reagenzien Konzentration Volumen (µl)
10 x PCR-Puffer 5
dNTPs je 10 mM/µl 1
bGFAPw1 100 pmol/µl 1
bGFAPw2 100 pmol/µl 1
Taq-Polymerase 5 U/µl 0,2
DEPC-Wasser 39,8
Je 48 µl der vorgemischten Reagenzien wurden entweder in 0,2 ml Achterstrips oder in 0,2 ml
Reaktionsgefäße (Mµlti ® -Ultra Tubes) hineinpipettiert und mit 2 µl der jeweiligen c-DNA-
Proben vermischt. Zusätzlich zur RT-Negativkontrolle wurde eine PCR-Negativkontrolle
mitgeführt. Die Reaktionsgefäße wurden gut verschlossen in den Thermocycler überführt und
folgendem Temperatur-Zeit-Programm unterzogen (Tabelle 7):
Tabelle 7: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern bGFAPw1 und
bGFAPw2
Programmschritt Temperatur Dauer (min:sec) Zyklenzahl
Initiale Denaturierung 95°C 15 1
Denaturierung 94°C 0:45
Anlagerung (Annealing) 72°C 1
45
Verlängerung 72°C 1:30
Finale Verlängerung 72°C 10 1
Warten bis Probenentnahme 4°C ∞ 1
Die hier erhaltenen PCR-Produkte wurden, sofern sie nicht sofort zur Aufreinigung und
nachfolgenden Sequenzanalyse verwendet wurden (siehe Kapitel 3.2.3.4) bei – 20°C gelagert.
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