Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
3.2.3 Molekularbiologische Methoden
3.2.3.1 RNA-Extraktion
Um RNA zu gewinnen wurde eine Methode nach CHOMCZYNSKI und SACCHI (1987)
angewandt, bei der das Gewebe in Guanidinisothiocyanat-Phenol-Lösung homogenisiert wird
(CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; MACDONALD et al., 1987). Nach Zugabe von
Chloroform und der anschließenden Zentrifugation wurde RNA in dem wässrigen Überstand
gelöst und von DNA und anderen Zellbestandteilen isoliert, die sich in der organischen Phase
befanden.
Für die RNA-Extraktion wurde peqGOLD RNAPure TM (peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen) verwendet. Die Probenaufbereitung erfolgte nach Herstellerangaben. Zunächst
wurde 1 ml peqGOLD RNAPure-Lösung in 2 ml Reaktionsgefäße vorgelegt. Von den zu
beprobenden Geweben und Fleischerzeugnissen wurden jeweils 100 mg in die peqGOLD
RNAPure-Lösung eingewogen, und mit einem Rotor-Stator-Homogenisator 20 Sekunden bei
ca. 38.000 Umdrehungen pro Minute (UpM) homogenisiert. Bei jeder neuen, an ZNS höher
konzentrierten Probe, wurde der Homogenisator je 20 Sekunden bei ca. 38 UpM in
Seifenlauge und in destilliertem Wasser gründlich gereinigt. Bei jedem neuen Versuchsansatz,
neuer Tierart oder Proben, die nicht in aufsteigender Konzentration folgten (z.B. zwei
verschiedene Gehirngewebeproben), wurde der Homogenisator gründlich mit Seifenwasser
und Flaschenbürste gereinigt und nachfolgend für mindestens 15 Minuten in 2 M Natronlauge
(NaOH-Lösung) verbracht. Bei der Untersuchung der Leberwurstproben wurde zur Reduktion
des Fettgehaltes nach Herstellerangaben das Gemisch nun bei 12000 x g für 10 Minuten
zentrifugiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurde das Gemisch 15 Sekunden mit
Hilfe eines Vortexers vermengt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine
Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Es folgte eine Zentrifugation für 5
Minuten bei 12000 x g. Dabei trennte sich die Probe in drei Phasen auf, von denen der
Überstand die RNA enthielt. Zur RNA-Präzipitation wurde der klare Überstand in neue 2 ml
Reaktionsgefäße pipettiert und mit 500 µl Isopropanol mit Hilfe eines Vortexers vermengt.
Nachfolgend wurde das Gemisch für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend
10 Minuten bei 4°C und 12000 x g zentrifugiert, und der Isopropanolüberstand abpipettiert.
Das verbleibende RNA-Pellet wurde nun zweimal gewaschen. Dafür wurde es mit 1 ml 75%
Ethanol überschüttet, 10 Minuten bei 4°C und 12000 x g zentrifugiert und nach Entfernung
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