Spezies- und gewebespezifischer Nachweis von bovinem ZNS ...

Material und Methoden
Anschließend wurden 2 µl der jeweiligen c-DNA-Proben, einschließlich der mitgeführten RT-
Negativkontrolle, hinzupipettiert. Zudem wurden eine PCR-Negativkontrolle, sowie eine
PCR-Positivkontrolle, bestehend aus Rinder-DNA, mitgeführt. Bei der Untersuchung der
Vollkonserve (s. Kapitel 3.2.5.1.4) besteht die Positivkontrolle aus der RT-Positivkontrolle.
Dann wurden die Reaktionsgefäße gut verschlossen in den Thermocycler überführt und
folgendem Temperatur-Zeit-Programm unterzogen (Tabelle 5):
Tabelle 5: Temperatur-Zeit-Programm der PCR mit den Primern GFAPforw und
GFAPrev
Programmschritt Temperatur Dauer (min:sec) Zyklenzahl
Initiale Denaturierung 95°C 15 1
Denaturierung 94°C 0:45
Anlagerung (Annealing) 65°C 1
50/45
Verlängerung 72°C 1:30
Finale Verlängerung 72°C 10 1
Warten bis Probenentnahme 4°C ∞ 1
3.2.3.3.2 PCR mit den Primern bGFAPw1 und bGFAPw2
Die bei dieser PCR eingesetzten Primer bGFAPw1 und bGFAPw2 wurden anhand der
Sequenzinformationen der bovinen GFAP-mRNA (GenBank accession no. Y08255)
entwickelt und amplifizieren einen Sequenzabschnitt der GFAP-mRNA von 399 bp Größe.
Damit wird ein Bereich amplifiziert, der das Amplifikat der PCR mit den Primern GFAPforw
und GFAPrev mit benachbarten Sequenzabschnitten einfasst. Die Primer haben folgende
Sequenz:
• bGFAPw1: 5`-GGCACCTTGAGGCAGAAGCTCCAG- 3`
• bGFAPw2: 5`-CTCATGCTTGGCCTGGCGGA- 3´
Der Mastermix für die PCR mit bGFAPw1 und bGFAPw2 Primern enthielt pro Reaktion
folgende Komponenten (Tabelle 6):
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