Rapporto finale - Metodologie di Monitoraggio dell ... - Momar

Biomarker indagati
Per questa ricerca è stata utilizzata una batteria di tre biomarker in grado di
evidenziare l’insorgenza di alterazioni cellulari (Saggio del Rosso neutro) e
genotossiche (Test della Cometa ed il Test del Micronucleo).
Il saggio del Rosso Neutro. Il test selezionato per l’indagine valuta lo stato di
integrità della membrana lisosomale, in base alla capacità di questi organuli di
mantenere al loro interno il colorante vitale Rosso Neutro (RN) (Lowe et al.,
1995). Il comparto lisosomale è molto sviluppato nei mitili dove svolge funzioni
legate alla digestione intracellulare, alla compartimentazione di sostanze
inquinanti, alla difesa immunitaria. I lisosomi sono noti per essere molto
sensibili alla tossicità di contaminanti di vario tipo (tra cui metalli pesanti, IPA,
sostanze lipofile persistenti) che si manifesta come alterazioni morfologiche e
funzionali (Moore 1988,).
Per ottenere i preparati destinati al saggio del Rosso Neutro, le valve dei mitili
sono state leggermente aperte per consentire il prelievo dell’emolinfa dal
muscolo adduttore posteriore mediante una normale siringa ipodermica. I
campioni di emolinfa prelevati da 30 individui sono stati riuniti in modo da
ottenere 6 pool di 5 individui ciascuno. Per ogni pool, circa 50 μl di emolinfa
sono stati posti su un vetrino portaoggetto e tenuti in camera umida e al buio
per 15 minuti in modo da far aderire le cellule al vetrino. Successivamente 40 μl
di soluzione di rosso neutro sono stati aggiunti ed i vetrini, coperti con il coprioggetto,
sono stati nuovamente posti in camera umida al buio per ulteriori 15
minuti. Trascorso il periodo di incubazione è stata effettuata una serie di letture
al microscopio ottico, ad intervalli regolari, allo scopo di valutare il tempo
necessario affinché il 50% delle cellule osservate mostrasse una evidente
diffusione del colorante vitale all’esterno dei lisosomi. Il tempo di ritenzione
del colorante all’interno dei lisosomi aumenta con lo stato di integrità cellulare
(Fig. 2).
110