Rapporto finale - Metodologie di Monitoraggio dell ... - Momar

Procedimento del test di fecondazione
Il test è stato allestito in tre repliche, secondo il protocollo con le modifiche
riportate dal laboratorio CIBM per la specie P. lividus: Short-term Methods for
Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to West
Coast Marine and Estuarine Organisms, EPA/600/R-95/136. August, 1995.
L’emissione dei gameti maschili e femminili viene provocata mediante
l’iniezione di 0,5 ml di KCL 1M nella cavità celomatica degli organismi. Lo
sperma (minimo da tre maschi) è stato raccolto “a secco” e conservato a 4°C. Le
uova (minimo da tre femmine) sono state raccolte ad umido singolarmente per
ogni femmina. Dopo la loro valutazione di maturità, sono state unite, diluite in
acqua di mare naturale filtrata alla concentrazione richiesta per il test e
conservate a 16°C. La quantità degli spermatozoi è stata determinata in camera
di conta (Thoma). Sulla base del conteggio è stata preparata la sospensione
dello sperma stimando il rapporto predefinito (1/15 000 ) tra uovo e
spermatozoi che garantisce la percentuale di fecondazione nei limiti del 75-
95%. Lo sperma è stato esposto per un’ora alle concentrazioni previste degli
elutriati (100, 50 e 25% ) e all’acqua di mare naturale filtrata (controllo
negativo). Le uova sono state inoculate dopo un’ora e lasciate in contatto con lo
sperma per venti minuti. Il test è stato bloccato mediante l’aggiunta di 1 ml di
formaldeide (37%). Le provette, contenenti gli zigoti, sono state conservate a
temperatura ~ 5°C fino alla loro valutazione. Al microscopio sono state contate
cento cellule e calcolata la percentuale degli zigoti in ogni campione. Nel test di
embriotossicità alla matrice acquosa testata sono stati esposti gli zigoti (uova
fecondate). In ogni provetta è stato aggiunto 1 ml della soluzione di uova
fecondate alla concentrazione 200 zigoti/ml. Le provette sono state incubate
per 72ore alla temperatura di 16±2°C. Il processo di sviluppo embrionale è stato
bloccato mediante l’aggiunta di 1 ml di formaldeide. Al microscopio sono stati
contati 100 embrioni e calcolata la percentuale dei plutei regolari in ogni
provetta. La sensibilità dei gameti e/o zigoti (EC50) è stata testata tramite
l’esposizione a concentrazioni crescenti del tossico di riferimento
Cu(NO3)2·3H2O.
Stima della tossicità
Al fine di considerare la percentuale delle uova non fecondate nel controllo è
stata applicata la correzione di “Abbott":
(x - y) * 100 * (100 - y) -1
x = % delle uova non fecondate nel campione da testare.
y = % delle uova non fecondate nel controllo.
La tossicità degli elutriati è stata stimata sulla base dei valori dell’EC20 ed EC50
calcolate con i metodi: Maximum Likelihood Probit oppure Trimmed
Spearman-Karber versione 1,5.
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