Rapporto finale - Metodologie di Monitoraggio dell ... - Momar

Rapporto sperma/uovo
Vengono prelevati 100 μl della soluzione di uova che vengono contate su di un
vetrino da orologio fino ad ottenere una soluzione con 1000 uova/ml. La
concentrazione dello sperma raccolto viene determinata raccogliendo con una
micropipetta con puntale per liquidi viscosi 25 μl di sperma e ponendoli in un
cilindro graduato contenente 25 ml di acqua dolce. Si ottiene così una soluzione
con fattore di diluizione (FD) uguale a 100. Da tale soluzione, dopo averla
agitata ed aver atteso qualche minuto, sono state prelevate alcune gocce e poste
sul vetrino superiore di una camera di Thoma, affinché la soluzione spermatica
diffonda all’interno per capillarità. Dopo aver atteso circa 10 minuti che gli
spermatozoi sedimentassero è stato effettuato il conteggio mediante
microscopio ottico (40 x). In base a tale conteggio viene determinato il fattore di
diluizione dello sperma e il conseguente volume da aggiungere alla soluzione
di uova per raggiungere una concentrazione sperma/uova di 20.000:1
Esecuzione
Il test in laboratorio è stato eseguito in contemporanea rispetto alla
metodologia in situ e i campioni d’acqua prelevati al momento delle prove in
campo sono stati utilizzati per il saggio di laboratorio. Quest’ultimo ha
richiesto anche l’allestimento di un controllo negativo con acqua di mare
filtrata e un controllo positivo impiegando, oltre ai gameti immediatamente
prelevati dagli organismi in laboratorio, i gameti trasportati in campo e
riportati in laboratorio per valutare la risposta dei gameti a seguito dello stress
legato al “trasporto”. Tale valutazione è stata fatta utilizzando il tossico di
riferimento Cu(NO3)2 in saggi di spermiotossicità e di embriotossicità, con
successivo calcolo dell’EC50.
In particolare una volta preparata la soluzione di uova (1000 uova/ml) e
determinata la concentrazione dello sperma, i gameti tenuti ancora separati,
vengono trasportati sul campo. Qui viene fatta avvenire la fecondazione e
vengono prelevati i campioni d’acqua. Di conseguenza al rientro in laboratorio
sono stati utilizzati gli embrioni e le acque provenienti dal campo. Di
quest’ultime ne sono stati prelevati 10 ml per campione, ponendoli in piastre
sterili per coltura in polistirene a sei pozzetti con coperchio. Per ciascun
campione sono state allestite 3 repliche. In ciascun pozzetto si è aggiunto 1 ml
della soluzione di embrioni proveniente dal campo, sulla quale sono state
osservate le anomalie dello sviluppo dopo 72 ore, quando è stato raggiunto lo
stadio di pluteo a 4 braccia.
Per quanto riguarda invece il controllo positivo sono state utilizzate soluzioni a
concentrazioni crescenti di nitrito di rame (24, 48, 60 ,72 μg/l), allestite in
piastre sterili con 3 pozzetti per ciascuna concentrazione. Utilizzando tali
soluzioni è stato allestito sia il saggio di embriotossicità, con gli stessi embrioni
impiegati per valutare i campioni d’acqua, sia quello di spermiotossicità, con i
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