Rapporto finale - Metodologie di Monitoraggio dell ... - Momar

Strumentazione: Per la purificazione è stata utilizzata una strumentazione HPLC
1100 Agilent con installata una colonna Phenogel 10 micron 100 A 250 mm x
21,5 mm i.d. (Phenomenex) munita di precolonna e con rivelatore UV impostato
a 254 nm. Le analisi sino state effettuate utilizzando un sistema Varian GC-
MS/MS comprendente un gascromatografo Varian CP-3900 con un iniettore
CP-1077 ed un autoiniettore CP-8410 interfacciato ad uno spettrometro di massa
a trappola ionica (Varian Saturn 2100). La separazione è stata ottenuta con una
colonna VF-5ms (30m x 0,25 mm d. i., 0,25 μm spessore film) fornita dalla
Varian. Come gas di trasporto si è utilizzato elio 99,9995% al flusso costante di 1
ml/min con una pressione pulsata di 40 psi della durata di 0,20 min. Per ciascun
campione si sono iniettati 0,5 μl con liner da 2 mm. di diametro installato.
1) estrazione per dialisi SPMD
I contaminanti concentrati negli SPMD sono stati separati dalla fase lipidica
mediante dialisi. Ciascun SPMD è stato prelevato dal recipiente di trasporto e
lavato per risciacquo con esano (100 ml). Successivamente l’SPMD è stato lavato
con acqua distillata su un vassoio di acciaio e spazzolato con delicatezza per
rimuovere il materiale adeso alla superficie. Dopo il lavaggio l’SPMD è stato
immerso in HCl 1 N per 30 secondi, risciacquato con acqua distillata ed acetone
e lasciato asciugare all'aria. Il campionatore passivo è stato posto in una
bottiglia di vetro scuro con tappo a smeriglio da 250 ml, coperto con almeno 180
ml di esano e lasciato a dializzare per 24 ore a 18°C. Al solvente sono stati
aggiunti gli standard interni. Si è decantato l'esano in un pallone da 500 ml e si è
ripetuto il procedimento per altre 8 h. Anche il secondo estratto è stato
decantato e riunito agli estratti precedenti. Gli estratti sono stati concentrati
mediante evaporazione sotto vuoto fino a 5 ml. Il solvente è stato ulteriormente
allontanato fino al volume di 1 ml sotto leggero flusso di azoto badando a non
superare la temperatura di 40°C. Gli estratti sono stati posti in vials e conservati
a -20°C fino al momento della ulteriore purificazione.
2) purificazione in GPC dell'estratto esanico degli SPMD proveniente dalla dialisi
Gli estratti esanici degli SPMD sono stati purificati in GPC (Petty et al. 2004). La
soluzione di calibrazione dei tempi di ritenzione è stata preparata sciogliendo i
seguenti composti in 10 mL di cloruro di metilene: 100 mg di dietilesilftalato, 10
mg di bifenile, 10 mg di naftalene, 2 mg di coronene, 10 mg di zolfo. L'eluizione
è stata effettuata utilizzando una miscela di cloruro di metilene/metanolo al 2%
al flusso di 4 ml/min. Successivamente sono stati iniettati i dializzati ridotti al
volume di 1 ml e scambiati con cloruro di metilene. La raccolta della frazione
purificata è iniziata al tempo corrispondente al 50% della distanza tra l'apice del
picco del dietilesilftalato e l'apice del picco del bifenile (picco 2), e terminata al
tempo corrispondente al 70% della distanza tra l'apice del coronene (picco 4) e
l'apice del picco dello zolfo (picco 5). Si sono aggiunti 100 μl di nonano e si è
ridotto quasi a secchezza i campioni sotto leggero flusso di azoto. Gli estratti
sono stati ripresi con 2 ml di esano per la purificazione e separati in due frazioni
per le successive determinazioni.
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