Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 93
durch die komplexe Matrix gelegen haben, durch die die Substanz teilweise von der
Xanthin-Oxidase nicht mehr als Substrat akzeptiert und die H2O2-Erzeugung somit
herabgesetzt wurde. Nach Subtraktion der unspezifischen Signale von den
jeweiligen XOD-Reaktor-Signalen wurden für das Detektionssystem Sensitivitäten
von 3,44 µA/mM für in Puffer bzw. 2,02 µA/mM für in HDF-Medium angesetzte
Xanthin-Standards erreicht. Trotz des ungünstigeren Verhältnisses von spezifischem/unspezifischem
Signalanteil erwies sich die Empfindlichkeit des entwickelten
Biosensorsystems damit als ausreichend hoch, um Xanthin in Fermentationsproben
bestimmen zu können.
3.2.3.7 Bestimmung von Xanthin in Realproben
Mit dem entwickelten Detektionssystem wurde die Xanthin-Konzentration von
Realproben bestimmt, die während einer Hochzelldichte-Fermentation von E. coli
(durchgeführt von Herrn M. Schmidt, Abt. Mikrobielle Systeme, GBF) genommen
wurden. Der Sensor wurde zunächst mit in HDF-Medium angesetzten Standards
kalibriert. Um eine mögliche Verringerung der XOD-Aktivität während der Meßreihe
zu berücksichtigen, wurde jeweils nach drei Injektionen von Realproben eine Ein-
Punkt-Kalibration mit einem 100 µM Xanthin-Standard durchgeführt und die
ermittelte Xanthin-Konzentration um die jeweilige Abweichung korrigiert. Der lineare
Meßbereich des Detektionssystems reichte von 0 bis 100 µM Xanthin mit einer
Geradengleichung von: Y = - 0,38 + 1,75·X und einem Regressionskoeffizienten
von 0,999. Proben mit einem Xanthin-Gehalt außerhalb dieses Bereichs wurden mit
HDF-Medium entsprechend verdünnt und anschließend nochmals analysiert. Der so
ermittelte Verlauf der extrazellulären Xanthin-Konzentration während einer über
einen Zeitraum von 37,5 Stunden durchgeführten E. coli-Fermentation ist in Abb. 39
dargestellt. Die Konzentration des sekretierten Xanthins war stark an die der Hauptkohlenstoffquelle
Glucose gekoppelt. Mit einer Abnahme der Glucose-Konzentration
und dem in diesem Zusammenhang langsam einsetzenden Streß antworteten die
Zellen mit dem Abbau ihrer rRNA, der zur Akkumulation von Xanthin im Medium
führte. Die höchsten Werte für die Konzentration der Nukleobase wurden daher auch
in der Phase der Kultivierung gefunden, in der praktisch keine Glucose mehr zur
Verfügung stand. Daß dieses Signal eine regulatorische Bedeutung besaß, wurde
durch die Abnahme der extrazelluären Xanthin-Konzentration nach der Glucose-