Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 150
während Compagnone und Guilbault (1997) den aus der H2O2-Oxidation
resultierenden Stromfluß zur ATP-Quantifizierung heranzogen.
Mit einem vergleichbaren HK/GOD-Aktivitätsverhältnis von etwa 1,5 wurde bei einer
Co-Immobilisierung zwischen zwei Polycarbonatmembranen, die anschließend vor
eine auf +650 mV polarisierte Platinelektrode gespannt wurden, über die elektrochemische
Umsetzung von H2O2 ein Detektionslimit von 10 µM und ein linearer Meßbereich
von 0 – 500 µM mit einer Steigung von 0,89 pA/µM ATP erreicht. Damit
zeigte dieser Sensor im Vergleich zum im Rahmen dieser Arbeit entwickelten eine
um den Faktor 57 verringerte Empfindlichkeit und ein um 23,5% erhöhtes Detektionslimit.
Überlegen zeigte sich dieses System jedoch in Bezug auf die Lagerstabilität, da
der Sensor über einen Zeitraum von sieben Tagen einsetzbar blieb. Möglicherweise
war diese verbesserte Stabilität trotz einer auch in diesem Fall angewendeten
Glutardialdehyd-Immobilisierung auf die zehnfach höhere BSA-Konzentration zurückzuführen,
die zur Produktion des Sensors eingesetzt wurde und bewirkte, daß die
Hexokinase in einer günstigen räumlichen Orientierung mit einem frei zugänglichen
aktiven Zentrum an die Membran gebunden wurde.
Das zweite - von Scheller und Pfeiffer publizierte - GOD/HK-System bestand aus
einer modifizierten Sauerstoffelektrode, mit der die aus der GOD-Reaktion
resultierende O2-Anahme in An- und Abwesenheit von ATP bei –600 mV detektiert
wurde. Beide Enzyme wurden hierzu in Polyacrylamid über Photopolymerisation
immobilisiert. Das so erzeugte enzymhaltige Gel wurde anschließend zwischen zwei
Membranen auf der Oberfläche der Sauerstoffelektrode fixiert. Der Sensor zeigte ein
lineares Ansprechverhalten zwischen 0 – 1 mM ATP mit einem Detektionslimit von
200 µM. Über die Sensitivität und die Lagerstabilität der Bi-Enzymelektrode wurden
keine Aussagen getroffen.
Verglichen mit diesen beiden Sensoren wurde mit der im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten
Bi-Enzymelektrode in Hinblick auf die Sensitivität und Nachweisgrenze ein
deutlich verbessertes System entwickelt. Darüber hinaus wurde auch die Produktion
des Sensors durch eine direkte Immobilisierung der beteiligten Enzyme auf der
silanisierten Platinoberfläche erleichtert, so daß keine weitere, wie bei den anderen
beiden Systemen nötige, Positionierung der Enzymschicht zwischen zunächst zwei
Membranen und anschließend vor der Elektrode erforderlich war. Die entwickelte
ATP-Elektrode ließ sich außerdem als Detektor in ein automatisiertes Fließinjektions-