Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

2. Material und Methoden 40
2.2.7 Amperometrische Bestimmung von Xanthin
Die amperometrische Detektion basierte auf der Reaktion der Xanthin-Oxidase
(XOD) mit molekularem Sauerstoff (s. S. 14) oder Kaliumhexacyanoferrat als Elektronenakzeptoren.
In Gegenwart von Sauerstoff wurde Xanthin zu Harnsäure und Wasserstoffperoxid
umgesetzt, aus dessen Oxidation ein Stromfluß resultierte, der zur Quantifizierung
von Xanthin herangezogen wurde. Der Mediator wurde als Elektronenakzeptor
eingesetzt, um eine Xanthindetektion bei deutlich geringeren Potentialen als +600
mV zu ermöglichen und eventuelle Interferenzen durch weitere elektrochemisch
aktive Substanzen weitgehend zu unterdrücken. Die XOD enthält eine FAD-Gruppe,
die bei der Substratumsetzung reduziert wird (Hille, 1994). Mit Hilfe des Hexacyanoferrats
wurde die prosthetische Gruppe re-oxidiert und das Enzym somit wieder für
die nächste Umsetzung regeneriert. Die Quantifizierung des Xanthins erfolgte in
diesem Fall über den Stromfluß, der durch die Oxidation des Mediators an der
Elektrode erzeugt wurde.
Xanthin + XOD-FAD
XOD-FADH 2 + 2 Fe(CN) 6 3-
Elektrode:
2 Fe(CN) 6 4-
2.2.7.1 XOD-Elektroden
Harnsäure + XOD-FADH 2
XOD-FAD + 2 Fe(CN) 6 4- + 2 H +
2 Fe(CN) 6 3- + 2 e -
Platinelektroden
Auf Platin-Dickschichtelektroden wurde die Xanthin-Oxidase ausschließlich über UV-
Polymerisation immobilisiert. Dazu wurden 10 µl einer XOD-Lösung (200 mg/ml) und
verschiedene Additive mit der UV-Paste vermischt und anschließend auf die
Arbeitselektrode aufgedruckt. Die resultierenden Biosensoren wurden hinsichtlich
ihres Interferenzverhaltens sowie ihrer Stabilität und Sensitivität im Ein-Kanal-
Fließsystem untersucht.
Graphitelektroden
Eine XOD-Konzentration von 4 mg/ml wurde über die Carbodiimid-Methode auf
aktivierte Graphit-Dickschichtelektroden immobilisiert. Auch diese Sensoren wurden