Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 137
Format mit immobilisierten Enzymen - einer wesentlichen Voraussetzung zur
Entwicklung eines wiederverwertbaren Systems - durchgeführt werden konnte. Ein
zweiter essentieller Punkt, die lokale Fixierung des Immobilisats innerhalb des
Kapillarnetzwerkes, ließ sich mit dem POCRE-1-Layout nicht realisieren, daher
wurde in diesem Chip zunächst allgemein der Einfluß der POD- und XOD-
Immobilisierung auf das CL-Signal untersucht.
Beide Enzyme wurden, wie unter 2.2.3.1 beschrieben, über Glutardialdehyd auf
Nucleosil-Beads mit einem Durchmesser von 5 µm gekoppelt. Zur erneuten
Überprüfung der CL-Detektionsreaktion wurde zu Beginn der Untersuchungsreihe
wiederum das POD/Luminol/H2O2-System eingesetzt. Die in Reservoir 1 enthaltene
POD-Lösung wurde dabei gegen eine gepufferte POD-Bead-Suspension
ausgetauscht, wobei darauf geachtet wurde, daß der Bead-Anteil nicht zu hoch war,
um so einer Verschließung der Kanalöffnung durch eine zu große Anzahl
sedimentierter Teilchen entgegenzuwirken. Daher wurden 50 µl der Suspension in
einem Bead/Puffer-Verhältnis (v/v) von etwa 1:10 in Reservoir 1 plaziert, so daß auch
bei einer kontinuierlichen Messung ausreichend POD-Beads zur Verfügung standen,
gleichzeitig das Trägermaterial aber stark genug verdünnt wurde, um einen
Verschluß der Kapillaröffnung zu verhindern. Mittels des in Tabelle 8 angegebenen
Spannungsprogramms wurden die Beads, wie zuvor die Enzymlösung, kontinuierlich
durch das Fließsystem transportiert und die emittierte CL an der optimierten
Detektorposition (550 µm hinter dem Y-Schnittpunkt) bestimmt. Unter Verwendung
der immobilisierten POD, 10 mM Luminol und 1mM H2O2 wurde mit 6050 mAU ein im
Vergleich zum gelösten Enzym um 10% erhöhtes CL-Signal erhalten. Durch den
Austausch des Wasserstoffperoxids gegen 10 mg/ml XOD und 1 mM Xanthin
verringerte sich dieses Signal jedoch auf 559 mAU (Abb. 65). Die Messung mit
gelöster POD hatte zu einer CL-Emission von 1322 mAU geführt, so daß die
Immobilisierung sich negativ auf die Xanthin-Bestimmung auswirkte und eine Signalabnahme
von 57,7% herbeiführte. Da für den homogenen und heterogenen Assay
identische absolute Enzymmengen eingesetzt wurden, resultierte die Signalverringerung
möglicherweise aus einer Adsorption von nicht umgesetztem Xanthin
an die POD-Beads, wodurch der Zugang von H2O2 zum Enzym erschwert wurde. Im
umgekehrten Fall, bei einer Immobilisierung der XOD und Verwendung gelöster POD
nahm die CL noch weiter ab (Abb. 65/mittlere Säule). Bei Vorlage von XOD-Beads,
die mit einer Enzymkonzentration von 10 mg/ml immobilisiert wurden, und 1 mM