Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

1. Einleitung 13
Untersuchungen durchgeführt werden, um die Reaktionsbedingungen zu finden,
unter denen alle beteiligten Enzyme eine möglichst optimale Aktivität und Stabilität
aufweisen. Als weiterer Nachteil erweist sich die für alle Detektionsreaktionen
erforderliche Anwesenheit des Coenzyms NADH bzw. NAD + , das im Gegensatz zu
ATP nicht wiedergewonnen wird und somit die Kosten für die Analyse deutlich
erhöht.
Glucose-Oxidase/Hexokinase-System
In diesem Fall handelt es sich um einen indirekten Nachweis auf der Basis der um
das Substrat Glucose konkurrierenden Reaktionen der Glucose-Oxidase (GOD) und
Hexokinase (HK). Durch die Umsetzung des Kohlenhydrats mittels Glucose-Oxidase
und der amperometrischen Detektion des Produktes H2O2 entsteht ein hohes
Grundsignal, das in Abwesenheit von ATP durch die Hexokinase-Reaktion nicht
beeinträchtigt wird. Liegt jedoch ATP in der Probe vor, kommt es zu einer
Konkurrenz beider Enzyme um das Substrat, woraus eine Verringerung des
Grundsignals resultiert. Mittels Differenzbildung läßt sich ATP anschließend
quantifizieren (Compagnone und Guilbault, 1997).
Glucose + O 2
Glucose + ATP
Glucose-Oxidase
Hexokinase
Gluconolacton + H 2O 2
Glucose-6-Phosphat + ADP
Für die ATP-Bestimmung mit Hilfe des Glucose-Oxidase/Hexokinase-Systems ist ein
Detektionslimit von 10 µM beschrieben (Compagnone und Guilbault, 1997). Im
Vergleich mit den beiden zuvor vorgestellten Methoden weist dieser ATP-Nachweis
somit die geringste Empfindlichkeit auf. Jedoch zeigt sich dieses System unter dem
finanziellen Gesichtspunkt als eindeutig überlegen, da es sich hierbei um verglichen
mit der Luciferase kostengünstige Enzyme handelt, die ohne nennenswerten
Aktivitätsverlust auch co-immobilisiert werden können. Die ATP-Analyse über das
Glucose-Oxidase/Hexokinase-System erfordert darüber hinaus neben Glucose
lediglich Magnesium als Cosubstrat und kann ohne den Zusatz weiterer Coenzyme
durchgeführt werden.