Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 161
Allgemein wird die Trennleistung beim Übergang von einem konventionellen System
auf ein miniaturisiertes CE-Format nicht signifikant beeinflußt. Im direkten LIF-Modus
wurde on-Chip bereits ein Detektionslimit von 200 nM erreicht (Effenhauser et al.,
1993). Herabgesetzt wird die Effizienz lediglich durch das kleinere zur Verfügung
stehende Detektionsvolumen, aus dem erhöhte (Konzentrations-) Nachweisgrenzen
resultieren. In Zusammenhang mit µCE-Systemen wurden Fluoreszenz-Detektionen
jedoch bisher im direkten Modus ausgeführt, so daß zur Diskussion der über den
indirekten Nachweis erzielten Ergebnisse keine Literaturdaten zur Verfügung stehen.
Mit konventionellen CE-Systemen wurden jedoch bereits verschiedene Trennungen
mit indirekter LIF-Detektion durchgeführt, unter anderem wurden auch Nukleotide,
allerdings kein Xanthin, über dieses Verfahren nachgewiesen (Gross und Yeung,
1989), wobei zur Detektion ein Laser mit einer von den im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführten Untersuchungen abweichenden anregenden Wellenlänge (331 nm)
eingesetzt wurde. Als Fluorophor wählten die Autoren Salicylsäure, das aufgrund
seiner guten Puffereigenschaften als Elektrolytlösung verwendet wurde, wodurch die
Sensitivität erhöht und ein Detektionslimit von 200 nM erreicht wurde. Aufgrund der
zur Verfügung stehenden Instrumente und eines zur Durchführung dieser Unter-
suchungen limitierten Zeitrahmens konnten für die µCE-Trennung keine weiteren
Optimierungen (z. B. Einsatz anderer Fluorophore, Veränderung des optischen
Systems) durchgeführt werden.
4.4.2 Mikro-Fließsystem
Für diese Applikation wurde zunächst auf das identische Chip-Format (POCRE)
zurückgegriffen, das schon für die CE-Trennung verwendet wurde, wodurch sich
auch die universelle Einsetzbarkeit integrierter mikrofluider Systeme verdeutlichte.
Über ein einfaches Spannungsprogramm wurden die für eine Xanthin-Chemilumineszenz-Detektion
nötigen Enzym- und Reagenzlösungen im Chip vermischt.
Um ein CL-Signal zu erhalten, mußte die Chip-Konfiguration für die beteiligten
Reaktionspartner (Luminol, POD, H2O2 bzw. Xanthin/XOD) sowie die Detektorposition
optimiert werden. Unter Einsatz von löslicher Peroxidase wurden für die
reine CL-Reaktion die höchsten Signale mit 10 mM Luminol, 1 mM H2O2 und 2 mg/ml
POD detektiert. Wurde die Wasserstoffperoxidlösung gegen eine Mischung aus
Xanthin und XOD in Reservoir 4 ausgetauscht, verringerten sich die Emissionen um