Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

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1. Einleitung 16 In der Kapillarelektrophorese wird die Trennung in dünnen Siliziumkapillaren (fused silica) durchgeführt, an die sich eine on-line UV- oder Fluoreszenzdetektion an- schließt. Diese Technik wurde zu einer leistungsstarken analytischen Methode entwickelt, die sich zunächst besonders bei der Trennung von kleinen organischen und anorganischen Ionen bewährt hat, mit der aber auch große Biopolymere wie DNA und RNA analysiert werden können. Gegenüber der klassischen Flachbett- Gelelektrophorese weist die CE einige Vorteile auf, so wird z. B. die Joulesche Wärme aufgrund des großen Oberflächen/Volumen-Verhältnisses in den Kapillaren effizient abgeführt und das Auftreten von Konvektionsströmen praktisch vollständig unterbunden. Im Vergleich zur Gelelektrophorese, bei der diese Abführung Schwierigkeiten bereitet, können bei der CE wesentlich höhere Spannungen angelegt und damit auch kürzere Analysenzeiten erreicht werden. Auch vom methodischen Gesichtspunkt betrachtet zeigt sich die CE überlegen, da zeitaufwendige Arbeitsschritte wie das Gelgiessen und die –beladung nicht länger notwendig sind und sich vor allem die Detektion, die sich bei der klassischen Variante lediglich über eine Anfärbung des Gels vornehmen läßt, deutlich vereinfacht hat. Historisch betrachtet wurden die Pionierarbeiten zur Entwicklung der Kapillarelektro- phorese bereits in den 50er und 60er Jahren durchgeführt, als Hjertén elektro- phoretische Trennungen in offenen Glasröhren demonstrierte (Hjertén, 1967). Die eigentliche Entwicklung der CE setzte dann erst gut zehn Jahre später mit den Arbeiten von Mikkers et al. (1979) und Jorgenson und Lukacs (1981) ein. Der Aufschwung der Methode war sowohl auf die Verfügbarkeit qualitativ hochwertiger Kapillaren mit sehr kleinen Innendurchmessern (20 – 100 µm) als auch auf neue Detektoren mit verbesserter Sensitivität zurückzuführen. ATP wird in der Regel durch Kapillarzonenelektrophorese (CZE) getrennt und im UV- Bereich oder durch indirekte Laser-induzierte Fluoreszenz (LIF) detektiert. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich auch nicht fluoreszierende Analyte wie ATP über Fluoreszenz-Detektion nachzuweisen, indem man dem Puffer einen fluoreszierenden Elektrolyten zusetzt, der eine ähnliche Mobilität besitzt wie die zu trennende Probe. In der Probenzone muß aufgrund der erforderlichen Elektroneutralität die Konzentration des Fluorophors geringer sein, was sich durch einen negativen Peak bemerkbar macht (Kap. 2.2.9.2). Ähnlich wie bei der HPLC kann
1. Einleitung 17 ATP als Adeninnukleotid aber auch mit Chloracetaldehyd derivatisiert und über direkte LIF nachgewiesen werden. Für Xanthin sind keine Modizierungsreaktionen mit einem Fluorophorlabel bekannt, da es über UV-Absorption oder elektrochemsich nachgewiesen wird, wobei die Trennung über CZE oder micellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) erfolgen kann. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die zur ATP- und Xanthin-Bestimmung in der Literatur beschriebenen CE- Trenntechniken und Detektionsmethoden. Analyt CE-Technik Detektion Probe Quelle ATP CZE indirekte LIF wäßrige Lösung Gross und Yeung, 1989 ATP CZE Fluoreszenz Zellextrakt Tseng et al., 1994 Xanthin MEKC UV214 nm Pharmazeutika Korman et al., 1994 Xanthin CZE UV280 nm Serum, Urin Shihabi et al, 1995 Xanthin CZE elektrochemisch Blutplasma Lin et al., 1997 Tab. 1: CE-Techniken zur Bestimmung von ATP und Xanthin 1.6 Mikrosysteme Miniaturisierte Systeme zur (bio)chemischen Analyse gewinnen in den Gebieten der Biochemie, analytischen Chemie und Mikrotechnologie immer größeres Interesse. Durch moderne Mikrotechniken wurden die technologischen Voraus- setzungen für die Miniaturisierung einzelner Komponenten und ihrer Integration zu einem Mikrosystem geschaffen. Die Mehrzahl der Mikrotechniken hat ihren Ursprung in der Mikroelektronik, die jedoch in Hinblick auf miniaturisierte analytische Systeme angepaßt und weiterentwickelt wurden. In diesem Zusammenhang hat die Bedeutung der Mikrofluidik in den letzten Jahren stark zugenommen. In mikrofluiden Systemen können Flüssigkeiten und Gase transportiert werden, wobei in der Regel eine Förderleistung von wenigen Mikrolitern pro Minute erreicht wird. Mit diesen Systemen können vielfältige Anwendungen, die vom reinen Transport bis hin zum Vermischen, Filtrieren, Separieren und Analysieren einer Probe reichen, durchgeführt werden. Mit der Miniaturisierung lassen sich einige Vorteile gegenüber den konventionellen Makrosystemen erzielen. So wird durch die Reduzierung der Systemgröße die
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5. Literatur 171 Liu, Z.; Li, T.; W
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5. Literatur 173 Rehák, M.; ânejd
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5. Literatur 175 Wei, H.; Wang, T.;
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