Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 153
3. Durch Kopplung mit weiteren enzymatischen Reaktionen, kann das Luciferase-
System auch zu einer sehr empfindlichen Detektion von ADP und AMP
herangezogen werden (Hollnagel, 1998).
Obwohl sich diese optische Detektionsmethode - wie beschrieben - auch in Fließsystemen
durchführen läßt, konnte dieses ATP-Bestimmungsverfahren jedoch nicht
in das etablierte FIA-System integriert werden, da eine geeignete Durchflußküvette
nicht zur Verfügung stand.
4.1.4 Beurteilung der Eignung des ATP-Systems zur Bioprozeßüberwachung
Das zentrale Problem der Bioprozeßüberwachung über eine on-line Bestimmung
der intrazellulären ATP-Konzentration, stellt zur Zeit nicht das Detektionssystem,
sondern viel mehr das Verfahren zur Extraktion des Nukleotids dar. Da intrazelluläre
Nukleotid-Pools sehr schnelle Umsatzraten besitzen, muß die Extraktionsmethode
praktisch sofort zu einer Inaktivierung aller enzymatischen Reaktionen führen,
wodurch bereits strenge Bedingungen an die Art der Probenahme gestellt werden.
Darüber hinaus muß sichergestellt sein, daß über dieses Verfahren alle nieder-
molekularen Substanzen quantitativ extrahiert und ausreichend hohe Wiederfindungsraten
geliefert werden. Einer Extraktion mit Perchlorsäure (PCA) werden
dabei die höchsten Ausbeuten zugeschrieben. Diese Methode erfordert neben der
eigentlichen Extraktion aber noch weitere Schritte. Die sedimentierten Proteine
müssen vom Überstand abgetrennt werden, dieser wiederum neutralisiert und filtriert
werden, bevor die eigentliche Analyse der Probe beginnen kann. Die Automatisierung
dieser zeitaufwendigen Probenvorbehandlung konnte bisher jedoch noch
nicht realisiert werden. Die ATP-Detektion erfolgt daher off-line über HPLC/CE-
Analytik. Eine on-line Analytik konnte bisher noch nicht etabliert werden, lediglich
über die Expression von Luciferase in E. coli und Zugabe von Luciferin zum Medium,
konnte die intrazelluläre ATP-Konzentration mit Hilfe einer in den Fermenter
integrierten optischen Faser bestimmt werden (Lasko und Wang, 1996). Jedoch kann
diese Methode nicht als allgemein gültiges Verfahren zur on-line ATP-Detektion
betrachtet werden, da sie nur angewendet werden kann, wenn die DNA des
entsprechenden E. coli-Stamms zuvor verändert wurde, so daß Luciferase vom
Bakterium exprimiert wird, womit man kein allgemein einsetzbares Monitoring-
System erhält. Darüber hinaus erhöht der Zusatz von Luciferin zum Medium den
Kostenaufwand bei Fermentationen erheblich.