Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

2. Material und Methoden 33
2.2.3.3 Immobilisierung auf Graphitelektroden über Carbodiimid
Der Immobilisierung von Enzymen auf Graphitelektroden über 1-Ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-carbodiimid
(EDC), das primäre und sekundäre Amine mit
Carboxylatresten verknüpft (Abb. 7), wurde ein elektrochemischer Aktivierungsschritt
vorgeschaltet. Hierdurch wurden die Elektrodenoberflächen dekontaminiert, die
Konzentration an funktionellen Gruppen erhöht und die aktive Fläche durch
Aufrauhung vergrößert (Csöregi et al., 1993). Zur Aktivierung durchliefen die
Elektroden für 10 min cyclisch einen Potentialbereich von 0 bis 1,8 V mit einer
Scanrate von 50 mV/s in 0,1 M KPP-Puffer pH 7. Um eine Mediatorschicht
abzulagern, wurde dieses Verfahren dahingehend modifiziert, daß ein Bereich von 0
bis 2,5 V in 15 Cyclen mit einer Geschwindigkeit von 200 mV/s in einer wäßrigen 0,1
M Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung durchfahren wurde. Unabhängig von der
elektrochemischen Vorbehandlung wurden die Elektroden anschließend gründlich mit
H2O dest. abgespült und für 90 min in eine gerührte 0,15 M EDC-Lösung in 50 mM
Natriumacetat-Puffer pH 5,5 getaucht. Nach erneutem Abspülen wurden 5 µl
Enzymlösung aufpipettiert und die Elektroden bei RT getrocknet.
COO -
COO -
COO -
+
O
C
NH Enzym
(CH2 ) 3N(CH3 ) 2
N
C
N
H 5 C 2
Abb. 7: Immobilisierung auf Graphitelektroden über EDC
2.2.3.4 Immobilisierung auf GOPS-aktivierte Träger
O
C
O
H 5 C 2
NH
C
N
(CH 2 ) 3 N(CH 3 ) 2
H 2 N
O
Enzym
H 5C 2-NH-C-NH-(CH 2) 3-N-(CH 3) 2
Über das Silanisierungsreagenz 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) lassen
sich Oxirangruppen auf einer Glasoberfläche einführen, die direkt mit den
Aminogruppen von Enzymen reagieren oder in sauren Medien zu einem vicinalen