Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

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Abkürzungen VII µTAS miniaturisiertes totales Analysesystem NAD Nicotinamidadeninnukleotid NTP Nukleotidtriphosphat PDMS Polydimethylsiloxan Pi Orthophosphat PMT Photomultipliertube POCRE Post Column Reaction POD Peroxidase RCC Reaction Chamber for Cells RNA Ribonukleinsäure RP Reversed Phase rRNA ribosomale Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s Sekunde(n) T Temperatur TAS totales Analysesystem UDP Uridindiphosphat UDP-GalNAc UDP-N-Acetyl-Galactosamin UDP-GlcNAc UDP-N-Acetyl-Glucosamin UTP Uridintriphosphat V Volt v/v % Volumenprozent w1/2 Peakbreite auf halber Höhe XOD Xanthin-Oxidase
1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Zielsetzung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten alternative Methoden zur bisher zur Bioprozeßüberwachung durchgeführten HPLC-Nukleotidanalytik etabliert werden, so daß eine on-line Überwachung über die Bestimmung relevanter Einzelparameter möglich und die Analysendauer deutlich verkürzt wird. Als alternative Methoden sollten vor allem enzymatische und elektrophoretische Prinzipien eingesetzt werden. Da nur für wenige der Nukleotide, die sich chromatographisch trennen lassen, enzymatische Detektionsmethoden zur Verfügung stehen, wurden die Untersuchungen anhand von zwei Analyten durchgeführt: zum einen wurde Xanthin ausgewählt, das als Einzelsubstanz eine direkte Kopplung mit dem Zellwachstum zeigte und zudem extrazellulär im Medium vorlag (Kap. 1.3.4), und zum anderen Adenosin-5´-triphosphat (ATP) als intrazelluläre Komponente, das zwar nur indirekt über den Adenylate Energy Charge (Kap. 1.3.2) Wechselwirkungen mit dem Wachstumsverhalten zeigte, als Speicherform der freien Energie aber eines der wichtigsten Nukleotide darstellt. ATP-Systeme könnten daher nur in Verbindung mit einem geeigneten Zellaufschlußverfahren eingesetzt werden, während Xanthin- Systeme über etablierte Probenahmemodule an Prozesse angekoppelt werden könnten. Die Basis zur Entwicklung geeigneter Detektionssysteme stellten zunächst amperometrische Biosensoren dar (Kap. 1.5.1), die anschließend in ein bereits etabliertes Fließinjektions-System integriert wurden. Darüber hinaus hatte die Arbeit zum Ziel, alternative Methoden zur Bestimmung von Xanthin unter Berücksichtigung elektrophoretischer Trennverfahren zu entwickeln (Kap. 1.5.3). Da jedoch für diese Methoden auch immer das Kriterium gelten mußte, daß sie ohne großen technischen Aufwand an einen Bioreaktor koppelbar sein sollten und sich dies mit kommerziellen CE-Instrumenten nicht ohne weiteres umsetzen ließ, wurde die Trennung auf miniaturisierte CE-Systeme übertragen (Kap. 1.6), die über ihr Netzwerk aus Mikrokanälen eine Verbindung mit der Außenwelt gewährleisten. Als weitere Vorteile bei der Nutzung dieser Systeme ergeben sich ein reduzierter Platzbedarf der prozeßbegleitenden Analytik sowie ein herabgesetzter Reagenzienverbrauch und Probenbedarf. Über letzteres sollte damit auch die kontinuierliche Überwachung der
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