Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 122
3.4 Miniaturisierte Analysesysteme zur Bestimmung von Xanthin
3.4.1 Mikro-Kapillarelektrophorese
Zur Trennung und indirekten LIF-Detektion von Xanthin in einem mikrofluiden
System (POCRE-1-Chip) wurde der in Abbildung 16 gezeigte Aufbau verwendet. Der
Laserstrahl wurde in einem Abstand von 32,08 mm vom Injektionsbereich auf Kanal
2 fokussiert, so daß sich der Detektionspunkt genau vor der ersten Krümmung dieser
Kapillare befand. Je nach der Verteilung der Moleküle über die Kanalbreite,
benötigen sie zum Passieren von Krümmungen unterschiedlich viel Zeit. Analytmoleküle,
die in Flußrichtung gesehen auf der rechten inneren Seite wandern,
müssen zur Umrundung der Kurve einen wesentlich kürzeren Weg zurücklegen als
Moleküle die auf der linken äußeren Seite migrieren (Culbertson et al., 1998). Die
unterschiedlichen Weglängen führen bei einer Detektion hinter der Kanalkrümmung
zu einer Bandenverbreiterung und damit zu einer Beeinträchtigung der Trennqualität.
Zur Vermeidung solcher Effekte, die auf geometrischen Eigenheiten des Chip-
Designs beruhen, wurde vor der Krümmung in Kanal 2 detektiert. Um beim Sammeln
der emittierten Fluoreszenz das durch das Rayleigh- und Raman-Streulicht ver-
ursachte Hintergrundsignal auszuschalten, wurde ein Bandpaßfilter (520 nm) in das
Mikroskop-Detektionssystem integriert. Des weiteren wurde eine Lochblende verwendet,
die das Sichtfeld des Mikroskop-Objektives auf einen kleinen Spot innerhalb
von Kanal 2 beschränkte. Somit wurde eine Abschwächung der emittierten
Fluoreszenz aufgrund von Randeffekten unterbunden, die aus einem über die Kanalbreite
hinausgehenden Sichtfeld resultiert hätten.
Für erste Voruntersuchungen wurden die Bedingungen zur Trennung von Xanthin
vom konventionellen CE-System (5 mM CE-Puffer, 50 µM Fluorescein) auf den
POCRE-Chip übertragen. Jedoch zeigte sich sofort, daß dies so nicht möglich war,
da sich zum einen die zur Verfügung stehenden Photomultiplier als zu sensitiv für
Fluorescein-Konzentrationen oberhalb von 2 µM erwiesen und zum anderen mit
einer Elektrolyt-Ionenstärke von nur 5 mM keine Trennung von Xanthin erreicht
wurde. Der Einsatz höherer Fluorescein-Konzentrationen ließ sich auch über eine
Reduzierung der Laserleistung (4,4 mW) nicht erzielen, da das Signal auch weiterhin
außerhalb des linearen Bereiches blieb. Auf die Möglichkeit, die Detektion von
Fluorescein auch oberhalb von 2 µM durch eine Modifizierung der fokussierenden