Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

2. Material und Methoden 46
2.2.9 Trennung von Xanthin über CE
Für die Trennung von Xanthin mittels Kapillarelektrophorese wurden ungecoatete
fused silica Kapillaren mit folgenden Dimensionen verwendet:
Innendurchmesser (ID): 50 µm
Gesamtlänge: 30 cm
Inlet-Detektor-Distanz: 22 cm
Die Kapillaren wurden zunächst konditioniert, indem sie 30 min mit 1 M NaOH und
anschließend jeweils 10 min mit H2O dest. und CE-Puffer gespült wurden. Die Probe
wurde über Druck (4 s) injiziert, durch Anlegen einer Spannung (10 - 20 kV) getrennt
und anschließend über UV-Absorption oder indirekte Laser-induzierte Fluoreszenz
detektiert. Zwischen den Injektionen wurde die Kapillare nochmals jeweils für 2 min
mit 0,1 M NaOH, H2O dest. und CE-Puffer gespült, um so die Adsorption von
Probenbestandteilen an der Kapillaroberfläche zu vermeiden, die zu einer Ver-
änderung des elektroosmotischen Flusses und somit zu verlängerten Migrationszeiten
geführt hätte.
2.2.9.1 UV-Detektion
Die UV-Detektion in einem Wellenlängenbereich zwischen 205 und 280 nm zählt
zu dem am häufigsten verwendeten optischen Nachweisverfahren für Xanthin, da die
Nukleobase in diesem Bereich eine hohe Absorption aufweist und der UV-Modus im
Gegensatz zur direkten Fluoreszenz-Detektion keine weiteren Derivatisierungs-
schritte erfordert.
In der vorliegenden Arbeit wurden alle CE-Trennungen mit UV-Detektion bei 280 nm
durchgeführt.
2.2.9.2 Indirekte Laser-induzierte Fluoreszenz-Detektion
Im allgemeinen kommen in der Analytik Detektionsmethoden zum Einsatz, die auf
chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Analyten basieren und den
Anforderungen der jeweiligen Anwendung entsprechen. So wird die UV-Detektion in
der Regel zum Nachweis von stark absorbierenden Substanzen verwendet oder die
Fluoreszenz-Detektion zur Bestimmung von geringen Konzentrationen leicht zu
derivatisierender Stoffe. Neben diesen direkten Verfahren besteht aber auch die