Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

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3. Ergebnisse 110 hohe Sensitivität für den Nachweis zu erzielen, sollte das Fluorophor neben den drei bereits zuvor genannten Bedingungen (Absorption, Quantenausbeute, Stabilität) keinen störenden Einfluß auf die eigentliche Trennung - keine Wechselwirkungen mit dem Analyt oder der Kapillaroberfläche - haben. Darüber hinaus sollte das Molekül zum Erreichen einer optimalen Austauschrate TR (transfer ratio) einfach geladen sein. Die Austauschrate ist definiert als die Anzahl der Fluorophor-Moleküle, die durch ein Analyt-Molekül verdrängt werden. Die Empfindlichkeit der indirekten LIF- Detektion wird dabei auch von der Stabilität des Grundsignals DR (dynamic reserve oder Signal/Rausch-Verhältnis) beeinflußt. Da das Analyt-Signal aus der Differenz zweier hoher Signale gebildet wird, ist zur Detektion geringer Probenkonzentrationen eine stabile Grundlinie unerläßlich. Der dritte Parameter, der einen Effekt auf die Sensitivität ausübt, ist die dem Puffer zugesetzte Fluorophor-Konzentration CF. Im allgemeinen nimmt die Empfindlichkeit der indirekten Detektion mit abnehmender Fluorophor-Konzentration zu, da so prozentual betrachtet mehr Moleküle von einer gegebenen Anzahl Analytmoleküle verdrängt werden. Jedoch verschiebt sich bei kleineren Konzentrationen auch das Signal/Rausch-Verhältnis der Grundlinie zu einem ungünstigeren Wert, so daß zur Erreichung eines möglichst geringen Detektionslimits die zugesetzte Menge der fluoreszierenden Substanz nicht beliebig klein gewählt werden kann. Das Detektionslimit Clim ist über die folgende Gleichung 16 mathematisch mit den drei Parametern verknüpft (Yeung und Kuhr, 1991): 3.3.2.2. Peakspektrum C lim CF = (16) ( DR⋅TR) Es ist bekannt, daß die Kapillarelektrophorese mit UV-Absorptionsdetektion in vielen Fällen nicht nur zu Signalen führt, die den einzelnen Probenkomponenten zugeordnet werden können, sondern es wurden noch weitere analyt-unspezifische Peaks beobachtet. Diese Signale treten auch im indirekten Detektionsmodus (UV und LIF) auf, wo sie die Auswertung der komplexen Elektropherogramme zusätzlich erschweren (Beckers, 1994). Analyt-Peaks treten bei einer indirekten LIF-Detektion aus folgenden Gründen auf:
3. Ergebnisse 111 1. Die Gegenwart einer fluoreszierenden Substanz innerhalb der injizierten Probe führt zu einem normalen (positiven) Peak 2. Die Gegenwart einer nicht fluoreszierenden Probenkomponente führt zu einer Verdrängung der fluoreszierenden Pufferionen und damit zu einem indirekten (negativen) Peak Darüber hinaus werden analyt-unspezifische Signale, die allgemein als Systempeaks bezeichnet werden, beobachtet. Ihre Entstehung läßt sich auf zwei Ursachen zurückführen. Beide Erkärungsansätze basieren auf dem Prinzip der Isotachophorese (ITP), die neben der CZE eine weitere Unterart der Kapillarelektrophorese bildet. Die Probe wird hierbei zwischen zwei Elektrolytlösungen mit unterschiedlicher Ionenbeweglichkeit aufgegeben, wobei die Mobilitäten der Probenionen zwischen denen des Leit- und Folgeelektrolyten liegen müssen. Wird ein elektrisches Feld angelegt, ordnen sich die Probenionen entsprechend ihrer Mobilität zwischen den beiden Puffersystemen an (ITP-Fokussierung). Nach der Trennung der Analyte aufgrund ihrer Mobilitäten, werden sie mit einer festgesetzten Geschwindigkeit, die durch den Leitelektrolyten bestimmt wird, durch die Kapillare transportiert. Die ITP wird heute weniger als Trennverfahren, sondern viel mehr zur on-line Aufkonzentrierung der Probe eingesetzt. Durch eine verminderte Leitfähigkeit innerhalb der Probenzone im Vergleich zum Elektrolyten entsteht dort durch den erhöhten Widerstand eine größere Feldstärke. Die Mobilität der Analyte wird hierdurch in bezug auf die Pufferionen erhöht und die Probenbestandteile akkumulieren sich an der Grenzfläche zum Elektrolyten aufgrund der dort wieder reduzierten Feldstärke. Die Aufkonzentrierung läuft fort bis sich die Leitfähigkeit der Probenzone der des Elektrolyten angeglichen hat und damit in beiden Bereichen identische Feldstärken vorliegen. Die geringere Leitfähigkeit führt somit bei der Injektion zu einer Aufkonzentrierung der Probe, die über das Kohlrausche Gesetz (Gl. 17) erklärt werden kann, das eine einheitliche Leitfähigkeit über den gesamten Bereich der Trennstrecke fordert. ci(x) ⋅zi ω ( x) = ∑ = konst(x) (17) µ i Dieses Gesetz gilt sowohl für starke mono- und multivalente als auch für schwache monovalente Elektrolyte. Die Summierung wird dabei über alle an einem gegebenen
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