Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 144
beobachten. Ein daraufhin im Becherglas durchgeführter Assay zur Überprüfung der
beteiligten Reagenzien (POD-Beads, 10 mg/ml XOD, 1 mM Xanthin, 1 mM Luminol)
führte zu einer sofort einsetzenden CL-Emission, die zwar schwach, aber dennoch
mit bloßem Auge zu erkennen war, so daß eine zwischenzeitlich aufgetretene
Enzym- oder Chemikaliendeaktivierung ausgeschlossen werden konnte. Möglicherweise
wurde die katalytische Aktivität der immobilisierten und örtlich fixierten POD
durch die migrierende XOD und/oder Xanthin unterbunden, was im Fall von ebenfalls
an eine feste Oberfläche gekoppelter, aber entlang des Kanalsystems transportierter
Peroxidase nicht eintrat.
Xanthin-Bestimmung über immobilisierte und gepackte XOD
Da für den Assay zur Xanthin-Bestimmung im POCRE-Chip jeweils nur eines der
beteiligten Enzyme in immobilisierter Form eingesetzt worden war, wurde vor der
Beladung des RCC-Chips mit einer Mischung aus POD- und XOD-Beads die CL-
Reaktion im Batch-Ansatz untersucht. Auch bei einer Kopplung beider Enzyme an
die Nucleosil-Beads konnte ohne weitere Hilfsmittel eine schwache CL-Emission
beobachtet werden. Nach der Feststellung, daß der Assay auch in dieser Form
grundsätzlich ablief, wurde der µ-Reaktor elektrokinetisch mit XOD- und POD-Beads,
die in einem Mischungsverhältnis von 2:1 (v/v) in Reservoir 3 vorlagen, beladen.
Auch in diesen Fall wurde über 1 mM und 5 mM Xanthin keine Lichtentstehung
beobachtet. Ein Austausch der Nukleobase gegen eine 100 µM H2O2-Lösung zeigte
jedoch auch nur ein sehr geringes Signal für die eigentliche Luminol-Reaktion.
Verglichen mit einem reinen POD-Reaktor wies das gemessene Signal nur noch
6,4% der ursprünglichen Höhe auf. Da das Packen dieses speziellen Kanalsystems
aus nicht zu ermittelnden Gründen anstatt der sonst üblichen 10 min mehr als zwei
Stunden andauerte, wurde zunächst vermutet, daß hierbei die Aktivität beider
Enzyme durch Wärmeeinstrahlung herabgesetzt wurde. Zur optischen Kontrolle des
Füllzustandes des Reaktors mußte der Chip mittels einer Tischlampe gut
ausgeleuchtet werden. Aufgrund der großen Nähe der Lichtquelle zur Glasoberfläche
kam es zu einer Übertragung der abgestrahlten Wärme auf den Chip und damit
möglicherweise zu einer Denaturierung der immobilisierten Enzyme. Die Verwendung
eines weiteren RCC-Chips, der die Beladung der Enzymbead-Mischung
innerhalb der üblichen Zeitspanne zuließ, führte jedoch bei Einsatz einer Kombination
von 1 mM Luminol und 100 µM H2O2 zu vergleichbar geringen CL-