Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

2. Material und Methoden 39
Die amperometrische Detektion erfolgte an einer Dickschichtelektrode, die sich in
einer Plexiglas-Durchflußzelle mit einem Volumen von etwa 30 µl befand. Bei
Verwendung von Enzymelektroden wurde das Fließsystem ausschließlich im Ein-
Kanal-Modus betrieben, während beim Einsatz von Enzymreaktoren in den Fließweg
2 ein weiterer mit CPG beschickter Reaktor integriert wurde. Die Glas-Beads in
diesem Reaktor waren mit BSA immobilisiert worden, so daß über den zweiten Kanal
die Bestimmung von Interferenzen möglich wurde.
2.2.6 Amperometrische Bestimmung von ATP
Zur enzymatischen Bestimmung von ATP wurde das bereits unter 1.5.1.1
beschriebene Glucose-Oxidase/Hexokinase-System eingesetzt, in dem beide
Enzyme um das Substrat Glucose konkurrierten. Die Detektion erfolgte amperometrisch
über das in der Reaktion der Glucose-Oxidase gebildete H2O2.
Die Vorschrift zur Immobilisierung auf Platinelektroden mittels Glutardialdehyd wurde
aufgrund des Bi-Enzymsystems folgenderweise modifiziert:
Enzymlösung: 7 µl GOD (600 U/ml) + 7 µl Hexokinase (300 U/ml)
BSA-Lösung: 3 µl 100 mg/ml
Glutardialdehyd: 3 µl 2,5%ig (v/v)
Alle Lösungen wurden in 0,1 M KPP-Puffer pH 7,5 angesetzt und vorsichtig in einem
Eppendorf-Reaktionsgefäß vermischt. 2 µl dieser Lösung wurden im Anschluß auf die
Arbeitselektrode eines Platin-Einfachsensors (Abb. 4a) pipettiert, der als
Detektionseinheit in das FIA-System integriert wurde.
Dem Carrierstrom wurde Glucose zugesetzt, so daß durch die von der GOD
katalysierte Reaktion ein kontinuierliches Grundsignal erzeugt wurde. Durch die
Injektion einer ATP-haltigen Probe trat eine Konkurrenz der beiden Enzyme um die
im Puffer vorliegende Glucose ein, da der Zucker in Gegenwart des Nukleotids
stöchiometrisch durch die Hexokinase phosphoryliert wurde. Je höher die ATP-
Konzentration der Probe war, desto mehr Glucose konnte phosphoryliert werden und
desto stärker wurde das Grundsignal der GOD-Reaktion herabgesetzt. Die ATP-
Quantifizierung erfolgte aus Differenzbildung dieser beiden Signale.