Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 155
Supplementen, die sich in vorherigen Untersuchungen zur Stabilisierung der
Glucose- und Lactatoxidase als geeignet erwiesen hatten (Rohm, 1996; Schumacher
et al., 1999) beeinflußte sowohl die Stabilität als auch die Aktivität der immobilisierten
XOD. Aufgrund der unbekannten Enzymstruktur lassen sich konkrete Wechselwirkungen
mit den einzelnen Additiven nicht belegen, jedoch weisen die erzielten Ergebnisse
darauf hin, daß die Diffusion des negativ geladenen Xanthins durch
kationische Zusätze begünstigt wurde. Möglicherweise wurde die XOD mit einem
isoelektrischen Punkt von 5,35 (Jakube, 1976) bei pH 8 auch besser durch positiv
geladene Zusätze vor der denaturierenden UV-Strahlung abgeschirmt, so daß eine
größere Menge aktiven Enzyms in der Membran verblieb, die erhöhte Stromstärken
gewährleistete. Darüber hinaus ist auch bekannt, daß Additive mit tertiären Aminogruppen
in den radikalischen Polymerisierungsprozeß einbezogen werden (Marabu
Produktinformation) und sich somit unter Einfluß der UV-Strahlung verändern
können, wodurch sich die Komplexität der möglichen Wechselwirkungen in der Paste
weiter erhöht und die Interpretation der Daten zusätzlich erschwert.
Zusammenfassend betrachtet wurde die Sensoraktivität durch den Zusatz von positiv
geladenen Additiven (Polylysin, DEAE-Dextran) als Einzelsubstanz oder in Kombination
mit weiteren Supplementen gegenüber der reinen XOD-Elektrode um bis zu
165% (135 nA) erhöht. Durch die Aktivität der einzelnen Sensoren wurde indirekt
auch ihre Stabilität beeinflußt, denn eine erhöhte H2O2-Produktion führte zur
Schädigung des Enzyms. Die Elektrode mit dem negativ geladenen BSA-Zusatz
zeigte daher mit 68% nach 100 Injektionen (2,5 h Meßdauer) die größte verbleibende
Stabilität. Allgemein konnte über dieses Immobilisierungsverfahren jedoch kein
Sensor mit ausreichender Stabilität und Sensitivität erhalten werden, um Xanthin im
relevanten Konzentrationbereich (5 bis 270 µM) bestimmen zu können.
4.2.2 XOD-Graphitelektroden
Nach Platin wurde Graphit als zweites Elektrodenmaterial zur amperometrischen
Xanthin-Bestimmung untersucht, wobei die XOD kovalent über die EDC-Methode
(Kap. 2.2.3.3) immobilisiert wurde. Auch in diesem Fall konnte das enzym-unabhängige
Xanthin-Signal nicht allein durch Aufbringen einer Diffusionsbarriere unterdrückt
werden. Wie schon am Platin beobachtet, mußte auch hier das Potential von
+600 mV auf +400 mV abgesenkt werden. Der Einsatz von Kaliumhexacyanoferrat
als Mediator bzw. als Aktivierungsreagenz der Elektrodenoberfläche bewirkte eine