Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 135
Tabelle 7 angegebene Konfiguration als erfolgreich bei der Erzeugung von Chemilumineszenz.
Aus diesem Grund wurde der vergleichsweise hohe Verbrauch an XOD
durch Mischen mit Xanthin akzeptiert.
Unter Berücksichtigung des Ergebnisses zur Optimierung der CL-Reaktion, das zum
Erreichen eines deutlichen Signals eine Mindestmenge von 1 mM H2O2 erforderte
und unter Annahme eines vollständigen enzymatischen Substratumsatzes, wurde zunächst
1 mM Xanthin mit einer XOD-Lösung (2mg/ml) in einem Reaktionsgefäß vermischt
und anschließend in Reservoir 4 pipettiert. Die CL-Emission, die mit diesem
Ansatz erhalten wurde, betrug nur 18,2% im Vergleich des unter identischen Bedingungen
(10 mM Luminol, 2 mg/ml POD) mit einer reinen 1 mM H2O2-Lösung
detektierten Signals (Abb. 64). Da es sich bei der XOD um ein Enzym mit geringer
Aktivität (0,1 U/mg) handelte, wurde diese Signalverringerung auf einen Mangel an
zur Verfügung stehenden aktiven Zentren des Enzyms zurückgeführt, um 1 mM
Xanthin in etwa 30 s vollständig zu H2O2 konvertieren zu können. Durch eine Erhöhung
der eingesetzten XOD-Menge auf 10 mg/ml konnte ein Anstieg des Signals
beobachtet werden, jedoch lag dieses mit 42% weiterhin deutlich unter dem Peroxid-
Signal zurück (Abb. 64/2. Säule). Die begrenzte Menge der für diese Versuchsreihe
zur Verfügung stehenden Xanthin-Oxidase führte zu einem Verzicht, durch noch
größere Enzymkonzentrationen einen höheren Substratumsatz und damit eine
weitere Erhöhung des CL-Signals zu erreichen. Um den Xanthin-Umsatz dennoch zu
steigern, wurde die Inkubationszeit der XOD/Xanthin-Mischung außerhalb des Chips
von etwa 30 s auf 10 min erweitert. Jedoch zeigte die verlängerte Reaktionsdauer
einen negativen Einfluß auf das CL-Signal, das mit 16,2% ein Niveau erreichte, das
im gleichen Größenordnungsbereich wie die mit 2mg/ml XOD erzielte CL-Emission
lag. Ursache für diese Signalverringerung war eine Inhibierung der XOD durch das
gebildete H2O2, wodurch die Xanthin-Konvertierung und damit die weitere H2O2-
Produktion herabgesetzt wurde. Wurde das Enzym/Substrat-Gemisch direkt in das
Chip-Reservoir pipettiert, wurde dieses Phänomen nicht beobachtet, da aufgrund der
unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten das Reaktionsprodukt vom Enzym
abgetrennt wurde. Daher wurde im folgenden auf eine ausgedehnte Präinkubationszeit
verzichtet. Mit einer XOD-Menge von 10 mg/ml (1 Unit), war es unter
den gewählten Bedingungen möglich, auch eine auf 0,5 mM herabgesetzte Substratkonzentration
zu detektieren (Signalhöhe 31,2%). Der Zusatz von EDTA, der bei der
amperometrischen Xanthin-Bestimmung im konventionellen FIA-System einen