Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 149
festgelegten Enzymaktivitätsverhältnis erhöhte sich die Sensitivität des Detektors mit
zunehmender Glucose-Konzentration in einem Bereich von 10 – 500 µM.
Zurückzuführen war dies darauf, daß beiden Enzymen eine größere Substratmenge
zur Verfügung stand, die zu einem vermehrten enzymatischen Umsatz und somit zu
einer anwachsenden Differenz zwischen Grund- und ATP-Signal führte, was sich
letztendlich auch in einer Verlängerung des linearen Meßbereiches ausdrückte.
Wurde der Kohlenhydrat-Zusatz jedoch über eine kritische Grenze hinaus erhöht,
hatten geringe ATP-Konzentrationen keinen Effekt mehr auf die Höhe des
Grundsignals und die untere Grenze des Bereiches verschob sich auf 62,5 µM ATP
(500 µM Glucose). Mit ansteigender Glucose-Konzentration erhöhte sich jeweils
auch das ATP-Detektionslimit. Allgemein erwies sich unter Berücksichtigung aller
Sensoreigenschaften ein Glucose-Zusatz in der Höhe von 50 µM zum Carrier als am
besten geeignet (Sensitivität: 51 pA/µM, Detektionslimit: 8,1 µM, linearer Bereich: 0 –
125 µM).
Als unzureichend erwies sich die Lagerstabilität der Bi-Enzymelektrode, die primär
auf eine Deaktivierung der Hexokinase zurückzuführen war. Nach Lagerung des
Sensors über Nacht bei 4°C nahm die Empfindlichkeit bereits um 39% ab und nach
einer Lagerungsdauer von 48 Stunden erfuhr das Grundsignal bei Injektion einer
ATP-Probe kaum noch eine Veränderung. Diese sehr schnell einsetzende
Inaktivierung der Hexokinase könnte möglicherweise durch eine Immobilisierung des
Enzyms in Gegenwart von Glucose verhindert werden. Bei einer Kopplung der HK
über Glutardialdehyd wurde beobachtet, daß das von der Glucose besetzte aktive
Zentrum des Enzyms während der Immobilisierung geschützt und so über eine
Lagerungsdauer von zwei Monaten stabil blieb (Hansen et al., 1993). Da in der
vorliegenden Arbeit zwei Enzyme co-immobilisiert wurden, die um die Glucose
konkurrierten, bleibt fraglich, ob die Stabilität des entwickelten Sensors auf diese
Weise hätte verbessert werden können, da die GOD im Gegensatz zur HK, die
Glucose in Abwesenheit von ATP nur bindet, das Substrat umsetzen würde und es
somit möglicherweise nicht mehr zur HK-Stabilisierung zur Verfügung stehen würde.
4.1.2 Beurteilung gegenüber vergleichbaren ATP-Systemen
In der Literatur sind zwei vergleichbare, ebenfalls auf dem Enzympaar Glucose-
Oxidase/Hexokinase beruhende ATP-Systeme beschrieben, wobei Scheller und
Pfeiffer (1980) ATP über eine Bestimmung der Sauerstoffabnahme detektierten,