Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 145
Emissionen. Eine Blockierung der Mikrokanäle durch mögliche eingedrungene Verschmutzungen
konnte als Ursache für die Signalabnahme ausgeschlossenen
werden, da ein für diese Kanalgrößen (30 und 580 µM) und -geometrien charakteristischer
Stromfluß von 1 µA bzw. 15 µA meßbar war. Die mit Hilfe eines
homogenen POD-Reaktors optimierten Bedingungen erwiesen sich damit als nicht
auf ein Bi-Enzymsystem übertragbar. Der gesamte Assay wurde durch das gemeinsame
Vorliegen von POD- und XOD-Beads empfindlich gestört. Mit einer
Kombination von 1 mM Luminol und 1 mM H2O2 wurde in diesem Fall ein Signal in
der Höhe von 444 mV detektiert, das unter Verwendung einer reinen POD-Packung
im allgemeinen mit einer 20-fach geringeren Substratkonzentration erzielt wurde.
Durch die Zugabe von löslicher POD in Reservoir 3 konnte außerdem ausgeschlossen
werden, daß dieses Phänomen aufgrund des XOD-Überschusses in der
Enzymlösung auf eine zu geringe Menge gepackter POD-Beads zurückzuführen war,
da das Signal unverändert blieb.
Der Einsatz von immobilisierter XOD zur Bestimmung von Xanthin erwies sich damit
in diesem Fließsystem als nicht geeignet. Zurückzuführen war dies vermutlich zum
einen auf ein ungünstiges Verhältnis zwischen der Größe der Nucleosil-Beads und
der XOD, durch das eine effiziente Immobilisierung des Enzyms verhindert wurde.
Zum anderen wurde durch die geringe Porengröße auch die Diffusion des Xanthins
zum Enzym erschwert, so daß sich hieraus die H2O2-Produktion so stark verringerte,
daß sie nicht mehr zur Erzeugung eines CL-Signals führen konnte. Darüber hinaus
wurde für den Assay ein pH-Wert von 9 gewählt, der sich als optimal für die Luminol-
Reaktion erwies, aber deutlich vom pH-Aktivitätsmaximum der XOD von 7,5
(Barman, 1969) abwich. Aufgrund dieses pH-Unterschiedes wurde die Aktivität der
löslichen XOD herabgesetzt, wodurch sich die deutlich verringerten Signale im
Vergleich zu einer reinen H2O2-Lösung erklären lassen. Da Luminol jedoch nur unter
alkalischen Bedingungen in den benötigten Konzentrationen gelöst werden konnte,
war eine Absenkung des pH-Wertes unter 9 nicht möglich.
Tabelle 29 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die im POCRE- und RCC-
Chip durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung von Xanthin über Chemilumineszenz-Detektion: