Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 107
Wie deutlich zu erkennen, wurde die Trennleistung eindeutig von der Probenmatrix
beeinflußt. Allein durch den KH2PO4-Anteil wurde die Ionenstärke der Probe im
Vergleich zum CE-Puffer um das Zehnfache angehoben. Aufgrund dieses Ionen-
Überschusses wurde die effektive Feldstärke in der Probe reduziert, dadurch verlangsamte
sich die Migration der Probenionen und die Fokussierung der Analyt-
Zonen wurde verhindert. Ein weiterer Effekt der erhöhten Leitfähigkeit der Probe und
der damit herabgesetzten Migrationsgeschwindigkeit führte zur Ausbildung der in
Abb. 48 gezeigten negativen Peaks. Nach dem Kohlrausch-Gesetz (Kap. 3.3.2.2)
wird eine einheitliche Leitfähigkeit über den gesamten Bereich der Trennstrecke gefordert.
Da die Leitfähigkeit der Probenzone größer als die des Trennpuffers war,
kam es bei der Injektion zu einer Verdünnung der Probe, die in einem negativen
Peak resultierte. Da diese Verdünnung zu einer quasi-stationären Phase führte, die
keine elektrophoretische Mobilität besaß und lediglich über den EOF transportiert
wurde, diente dieser Peak zur Bestimmung der elektroosmotischen Fließgeschwindigkeit
(Macka et al., 1997). Im Elektropherogramm des Mediums folgte dem
EOF-Peak ein kleiner positiver Peak, der jedoch nicht weiter identifiziert wurde. Eine
Xanthin-Konzentration von 2 mg/l konnte in dieser Matrix detektiert werden
(schwarzes Elektropherogramm), jedoch reduzierte sich die Peakhöhe im Vergleich
zur rein wäßrigen Xanthin-Lösung um 96% auf 54 mAU und die Migrationszeit verlängerte
sich von 90,2 s auf 100,8 s. Die zeitliche Verschiebung der beiden oben gezeigten
Analysen, die gut am EOF-Peak zu erkennen war, stand in keinem Zu-
sammenhang mit der Probenzusammensetzung, sondern war darauf zurückzuführen,
daß die Kapillare zwischen den einzelnen Läufen nicht ausreichend gespült
wurde. Spülschritte von jeweils 1 min mit 0,1 M NaOH, H2O dest. und CE-Puffer er-
wiesen sich als zu kurz, um adsorbierte Substanzen von der Kapillaroberfläche zu
entfernen und einen reproduzierbaren EOF zu gewährleisten. Durch eine Erweiterung
der jeweiligen Spülschritte auf zwei Minuten konnte dieses Phänomen jedoch
aufgehoben und stabile Migrationszeiten erreicht werden.
Da die hohe Ionenstärke der Probenmatrix das Xanthin-Signal zu einem großen
Anteil unterdrückte, wurde das Medium im Anschluß 1:5 mit H2O dest. verdünnt.
Zwei in dieser verdünnten Matrix angesetzte Xanthin-Standards (0,5 und 1 mg/l)
wurden anschließend analysiert.