Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

4. Zusammenfassung und Diskussion 162
81,8% (1 mM Xanthin/2 mg/ml XOD) bzw. 58% (1 mM Xanthin/10 mg/ml XOD), was
auf eine zu geringe XOD-Enzymaktivität zurückzuführen war. Die Untersuchungen
wurden bei pH 9 durchgeführt, da sich die Löslichkeit von Luminol im basischen
Bereich verbessert, wodurch jedoch die Aktivität der XOD mit einem pH-Optimum
von 7,5 (Barman, 1969) reduziert wurde. Um den Xanthin-Umsatz auch ohne eine
weitere Erhöhung der eingesetzten Enzymmenge zu verbessern, wurden XOD und
Xanthin für 10 min außerhalb des Chips vorinkubiert. Aufgrund einer schon bei den
XOD-Elektroden beobachteten Schädigung des Enzyms bei höheren H2O2-
Konzentrationen, stieg das Signal jedoch nicht an, sondern reduzierte sich im
Vergleich zur ohne Vorinkubation beobachteten Emission deutlich, daher wurde auf
einen solchen Schritt im weiteren verzichtet. Das experimentelle Detektionslimit
wurde bei Einsatz von löslicher POD und XOD mit 500 µM ermittelt.
Die Immobilisierung der POD führte zu keiner Verringerung des reinen CL-Signals,
bei Austausch der H2O2- gegen die Xanthin/XOD-Lösung wurden jedoch geringere
Emissionen (42,3%) detektiert als mit der gelösten POD-Form, was möglicherweise
durch eine Adsorption von migrierendem nicht umgesetzten Xanthin an die POD-
Beads und einer damit verbundenen Deaktivierung des Enzyms verursacht wurde.
Im umgekehrten Fall, bei Verwendung gelöster POD und immobilisierter XOD sanken
die Signale auch bei einer Erhöhung der Xanthin-Konzentration auf 5 mM auf 5,3%
ab. Diese Emissionsverringerung ließ sich auf eine ineffiziente XOD-Immobilisierung
zurückführen, die sowohl durch die Bead- (5 µm) als auch durch die Porengröße
(1000 Å) bedingt wurde. Ein Trägermaterial mit einem CPG-ähnlichen Durchmesser
von etwa 150 µm (Kap. 3.2.3) konnte aufgrund der Kanalgeometrien nicht eingesetzt
werden. Jedoch wurde, wie schon zu Beginn dieses Abschnitts erwähnt, mit dieser
Anwendung die vielseitige Nutzbarkeit der integrierten mikrofluiden Systeme
demonstriert. Über eine einfache Veränderung des Spannunsprogramms bzw. der -
höhe konnte der POCRE-Chip sowohl für elektrophoretische Trennungen als auch
als Fließsystem genutzt werden.
Ähnlich wie für den indirekten LIF-Detektionsmodus zählt auch die Chemilumineszenz-Messung
zu einem Verfahren, das in Zusammenhang mit Mikrochips
noch nicht ausreichend etabliert ist, so daß nur wenige vergleichende Literaturdaten
zur Verfügung stehen. CL wurde bisher nur als Detektionsverfahren nach einer CE-
Trennung eingesetzt, wobei es sich bei dem Analyten um einen POD-gelabelten Anti-