Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 138
Xanthin in Reservoir 4, betrug die emittierte CL lediglich 60 mAU. Verglichen mit dem
Signal, das aus dem entsprechenden Experiment mit gelöster XOD resultierte, wurde
eine Abnahme der CL-Emission um 95,5% beobachtet. Eine Erhöhung der Substratkonzentration
auf 5 mM hatte keinen nennenswerten Einfluß und verstärkte das
Signal lediglich auf 70 mAU.
Chemilumineszenz [mAU]
600
500
400
300
200
100
0
2 mg/ml POD 1immobilisiert 2 mg/ml POD 2 gelöst
2 mg/ml POD 3 gelöst
10 mg/ml XOD gelöst
10 mg/ml XOD immobilisiert 10 mg/ml XOD immobilisiert
1 mM Xanthin
1 mM Xanthin
5 mM Xanthin
Abb. 65: Einfluß der Enzymimmobilisierung auf das CL-Signal im kontinuierlichen Fließmodus
Dieser große Verlust war durch die Immobilisierung der XOD auf die im Vergleich
zum unter 3.2.3. verwendeten CPG (120 – 200 µm) kleineren Nucleosil-Beads (5 µm)
zu erklären. Aufgrund der kleineren Oberfläche wurde möglicherweise eine geringere
Menge XOD immobilisiert, woraus die deutliche Signalabnahme resultierte. Darüber
hinaus wiesen die Poren dieser Beads (1000 Å) nicht die vom Hersteller zur Immo-
bilisierung von Enzymen wie der Xanthin-Oxidase mit einem Molekulargewicht von
300 kDa empfohlene Mindestgröße von 1400 Å auf, wodurch die Effektivität der
kovalenten Kopplung möglicherweise nochmals eingeschränkt wurde. Aufgrund der
geringen Kapillardimensionen war es jedoch nicht möglich, ein Trägermaterial mit
größerem Durchmesser für die Untersuchungen in einem Mikrochip einzusetzten.
Wurden beide Enzyme in immobilisierter Form eingesetzt, konnte keine CL-Emission
mehr beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigten aber dennoch, daß die Durchführung
von enzymatischen Assays in einem mikrofluiden System möglich waren und
daß die Chemilumineszenz-Detektion eine geeignete Alternative zur sonst üblichen
LIF-Detektion darstellte.