Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

2. Material und Methoden 53
2.2.10.6 Enzymassay
Für den enzymatischen Nachweis von Xanthin wurde ein Bi-Enzym-System in
Verbindung mit einer Detektion über Chemilumineszenz (CL) gewählt:
Xanthin +
Luminol +
H2O2 +
O 2
OH -
XOD
POD
Das durch die Konvertierung von Xanthin durch die Xanthin-Oxidase produzierte
H2O2 wurde in einer nachfolgenden Peroxidase-katalysierten Reaktion mit Luminol in
einem basischen Medium zu 3-Aminophthalat umgesetzt. Als weiteres Produkt
wurde hierbei ein Photon mit einer Wellenlänge von 425 nm emittiert. Da bei dieser
Detektionsmethode auf eine externe Lichtquelle verzichtet werden konnte, reduzierte
sich das in Abbildung 16 dargestellte optische System auf das Mikroskop-Objektiv,
über das die Chemilumineszenz gesammelt und, ohne zuvor eine Lochblende oder
einen Bandpaßfilter passiert zu haben, an einen mit höchster Empfindlichkeit (+ 900
V) arbeitenden Photomultiplier weitergeleitet wurde.
2.2.10.7 Kontinuierliches Mikrofließsystem
Harnsäure
H 2 O 2
Die Untersuchungen zur enzymatischen Xanthin-Bestimmung in einem Mikrofließsystem
wurden in dem bereits schon beschriebenen POCRE-1-Chip durchge-
führt. In diesem Fall wurde das Kapillarnetzwerk nicht zur Injektion und Separation
der Probe genutzt, sondern als kontinuierliches Fließsystem betrieben. Mit der in
Tabelle 7 angegebenen Konfiguration und dem Spannungsprogramm wurden die in
den Reservoiren 1-4 befindlichen Lösungen kontinuierlich in Richtung Reservoir 5
transportiert; dabei dienten die drei Schnittpunkte der Seitenkanäle 1, 3 und 4 mit
dem Hauptkanal als Mischstücke, an denen jeweils Reagenzien, die für die
Gesamtreaktion von Bedeutung waren, zugegeben wurden. Die beteiligten Enzyme,
XOD und POD, wurden sowohl in Lösung als auch in immobilisierter Form
eingesetzt, indem sie - wie unter 2.2.3.1 beschrieben - kovalent auf Nucleosil-Beads
gebunden wurden.
+
3-Aminophthalat + Licht
425 nm