Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid- Analytik in der ...

3. Ergebnisse 56
3. Ergebnisse
3.1 Amperometrische Bestimmung von ATP
Zur Bestimmung von ATP wurde das bereits unter 1.5.1.1 vorgestellte
Enzympaar Glucose-Oxidase/Hexokinase gewählt, da zum einen über dieses
System eine amperometrische Detektion ermöglicht wurde und der resultierende
Sensor so mit weiteren zur Bioprozeßkontrolle relevanten Enzymsensoren in ein
Mehrkanal-Fließinjektionssystem integriert werden konnte. Zum anderen erforderte
diese ATP-Bestimmungsmethode weder die Kopplung einer dritten enzymatischen
Reaktion noch wurde der Zusatz von Coenzymen nötig. Aus diesem Grund erwies
sich dieser Nachweis letztendlich gegenüber den beiden anderen in Kap. 1.5.1.1
beschriebenen Verfahren als geeigneter, da sich sowohl der Kosten- als auch der
Zeitaufwand zur Optimierung der für beide Enzyme günstigsten Assaybedingungen
deutlich reduzierte.
Für die amperometrische ATP-Bestimmung wurden beide Enzyme auf einer Platin-
Dickschichtelektrode über Glutardialdehyd co-immobilisiert. Durch die Glucoseoxidation,
die von der GOD katalysierte Reaktion, entstand H2O2, das an der
Elektrodenoberfläche detektiert wurde. Bei Anwesenheit von ATP in der Probe,
wurde die Glucose teilweise in der Hexokinase-Reaktion umgesetzt und die Menge
des produzierten Wasserstoffperoxids somit herabgesetzt.
3.1.1 Einfluß der Magnesiumionen-Konzentration
Der enzymatische Mechanismus der Hexokinase-Reaktion erfordert als Cosubstrat
neben dem ATP zusätzlich Magnesium (Colowick, 1973):
HK HK . Glucose HK . Glucose . ATPMg HK . Glucose-6-P . ADPMg HK . Glucose-6-P HK
Daher wurde zunächst an einer silanisierten Platin-Dickschichtelektrode untersucht,
welchen Einfluß der Zusatz von MgCl2 zum Carrier-Puffer auf das reine
elektrochemische H2O2-Signal ausübte. Hierzu wurde die Elektrode als Detektor in
das im Ein-Kanal-Modus betriebene FIA-System (Abb. 9) integriert, eine 1 mM H2O2-
Lösung injiziert und die resultierende Stromdichte bei verschiedenen Magnesium-