Materiali e Tecnologie per la realizzazione di sostituti - FedOA ...

114 - CAPITOLO 4
dove:
εred570 indica il coefficiente di estinzione molare dell’Alamar Blue ridotto a 570nm
εred600 indica il coefficiente di estinzione molare dell’Alamar Blue ridotto a 600nm
εox570 indica il coefficiente di estinzione molare dell’Alamar Blue ossidato a 570nm
εox600 indica il coefficiente di estinzione molare dell’Alamar Blue ossidato a 600nm
A570PCL indica l’assorbanza del supporto a 570nm
A600PCL indica l’assorbanza del supporto a 600nm
A570CRT indica l’assorbanza del controllo negativo a 570nm
A600CRT indica l’assorbanza del controllo negativo a 600nm.
In particolare è possibile valutare il numero di cellule presenti in un substrato
dopo la semina o la coltura in vitro costruendo preventivamente una curva di
taratura per numero di cellule note. Quindi per un numero di cellule assegnato
calcolare sperimentalmente la % di riduzione ed entrare nella curva di taratura per
valutare il numero di cellule vitali all’interno del costrutto.
c) Effetto della semina dinamica sulla distribuzione cellulare: analisi al microscopio confocale
La distribuzione cellulare all’interno delle strutture tridimensionali analizzate è
stata valutata attraverso un’analisi al microscopio confocale (Zeiss LSM 510) che
fornisce una misura qualitativa della vitalità cellulare a 0h, 24h e 48h dalla semina.
La localizzazione delle cellule è stata effettuata attraverso un opportuno probe
fluorescente in grado di “contrassegnare” le cellule vitali ed un altro probe in
grado di evidenziare le cellule morte.
In particolare, i probe molecolari utilizzati sono la calceina, di colore verde, e
l’etidio bromuro, di colore rosso.
Il campione è stato immerso in una soluzione di calcina ed etidio bromuro in
rapporto 1:1 diluita in terreno di coltura ed incubato per circa 1 ora a 37°C.
Lo scaffold viene quindi lavato con PBS ed analizzato al microscopio confocale.
Il microscopio confocale permette la visualizzazione e l'analisi dei probe
fluorescenti determinando una stima della vitalità delle cellule nello scaffold.
Si osserva che, diversamente da quanto avviene in un microscopio tradizionale, in
un microscopio a fluorescenza la sorgente luminosa è laser.
Ne segue che la risoluzione è molto alta e le caratteristiche della luce risultante
(estrema coerenza, alta intensità e lunghezza d'onda unica) consentono di evitare i
fenomeni di aberrazione e diffrazione tipiche della luce prodotta dalle lampade a
incandescenza [ 143 ].