Materiali e Tecnologie per la realizzazione di sostituti - FedOA ...

154 - CAPITOLO 5
E’ stata effettuata, quindi, una misura indiretta della vitalità cellulare.
Dalla valutazione dell’assorbanza del campione a 570 e 600nm allo
spettrofotometro si può risalire alla percentuale di riduzione dell’Alamar Blue
attraverso la precedente relazione.
Entrando con il valore calcolato di %red nella curva di taratura è possibile
individuare il numero di cellule corrispondenti presenti nello scaffold.
Normalizzando rispetto al numero di cellule inizialmente introdotto nello
scaffold (ottenuto attraverso una conta cellulare) è stato possibile ottenere una
stima dell’efficienza della semina all’interno dello scaffold.
In particolare è stata realizzata una semina di osteoblasti utilizzando un numero
di cellule peri a 2.5 10 5 compreso nel dominio di linearità della curva di taratura.
I risultati del test di semina effettuato in triplicato sono stati confrontati con
quelli di un test statico.
Si osserva che la percentuale di riduzione nel caso dinamico è più che doppia con
un grado di efficienza della semina pari al 67%.
Statica Dinamica
% red 20.8 43.1
n. cellule - 1.7 10 5
Efficienza - 67%
Tabella 44: Test AB reduction – Confronto tra semina statica e semina dinamica - Stima del
grado di efficienza della semina
b) analisi al microscopio confocale
Al fine di valutare l’effetto indotto dalla diversa procedura di semina sulla vitalità
ed sulla distribuzione cellulare le cellule sono state colorate con calceina ed etidio
bromuro (C/EtBr).
A seguito della colorazione, l’analisi al
microscopio confocale mostra cellule
vitali con un citoplasma di colore
verde. Al contempo, cellule morte con
citoplasma rosso indicano
l’interazione dell’etidio bromuro con il
DNA della cellula dovuto alla
penetrazione del probe attraverso la
membrana cellulare non più integra.
L’analisi è stata effettuata utilizzando
Figura 84: Analisi al microscopio confocale:
valutazione della profondità di semina
attraverso modalità Z-stack