Dissertation Klaus Heitkamp 1999

4 Ergebnisse und Diskussion 89über den Reaktionsansatz geleitet. Nach vier Stunden Reaktionszeit wurden die nunmehrtiefrot gefärbten Beads abfiltriert und mit 25 ml tridestilliertem Wasser gewaschen. Die Beadswurden unter Wasser bei 4 °C gelagert. Da das Filtrat noch eine deutlich rote Färbungaufwies, wurde davon ausgegangen, daß die unter den gegebenen Bedingungen maximalmögliche Menge an Mikroperoxidase an den Beads immobilisiert worden war.4.5.5 Bestimmung der TrägerbelegungUm eine genaue Aussage über den Erfolg der Immobilisierung bei den einzelnen Beadsortenzu treffen, war es notwendig, die Menge des jeweils gebundenen Enzyms zu bestimmen. Inder Literatur werden dazu verschiedene Verfahren vorgeschlagen. Die einfachste Methode istdie Differenzbildung aus eingesetzter und nach der Immobilisierung in Reagenzlösung undWaschflüssigkeiten vorliegender Enzymmenge. 154 Die Bestimmung des Enzymgehaltes inden Lösungen kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen. So bestimmte Jacob denEnzymgehalt bei der Immobilisierung von Mikroperoxidase, Katalase und Meerrettichperoxidaseüber die atomabsorptionsspektrometrische Messung des Eisengehaltes der jeweiligenLösung. 148 Gabel und Axén nutzten verschiedene titrimetrische und photometrische Methoden,bei denen ein Reagenz mit charakteristischen Gruppen des Enzyms (in der Regel Carboxyl-,Carbonyl-, Amino- oder Thiol-Gruppen) zu einer gefärbten Verbindung oder einemfarbigen Komplex reagierte. 155 Aus der Intensität der Färbung konnte dann der Enzymgehaltberechnet werden. Auch die elementaranalytische Untersuchung des Immobilisates ist beigenau bekannter Zusammensetzung des Enzyms möglich. Allerdings sind die daraus erhaltenenWerte in der Regel mit großen Fehlern behaftet, da der C-, H- und N-Gehalt der mitdem Enzym belegten Beads im Verhältnis zur Gesamtmasse sehr klein ist, und somit eineBestimmung im untersten Meßbereich erfolgt. 148Da jeweils nur geringe Mengen mit MP-11 belegter Beads zur Verfügung standen, und dieelementaranalytische Bestimmung stark fehlerbehaftet schien, wurden die Enzymgehalte derin Kapitel 4.5.4 hergestellten Enzymimmobilisate mittels AAS über die Eisenkonzentrationbestimmt. Dazu wurde zunächst die oben genannte "Differenz"-Methode eingesetzt. UmMatrixeinflüsse auszuschließen, wurde mit der Standardadditionsmethode gearbeitet (vgl.Kapitel 6.8). Zur Überprüfung der so erhaltenen Werte wurde im Anschluß an dieImmobilisierung jeweils eine geringe Menge der Beads mehrere Tage bei 120 °C getrocknet