Dissertation Klaus Heitkamp 1999

36 4 Ergebnisse und DiskussionProbe-Nr. ∆E 234 in rel.Einheiten∆t in min ∆E 234 /∆t Vol. Enzymlösungin mlAktivität der Enzymlösungin Units/ml1 0,68 1,57 0,43 0,02 217022 0,51 1,52 0,34 0,02 168133 0,67 1,27 0,53 0,02 262504 0,74 2,33 0,32 0,02 158575 0,78 1,43 0,54 0,02 272096 0,88 1,73 0,51 0,02 253847 0,76 1,30 0,58 0,02 29230Mittelwert 23207 ± 5220Tabelle 5Bestimmung der Aktivität von Lipoxidase aus KartoffelnDamit ergab sich mit dem zuvor bestimmten Proteingehalt pro ml Lösung eine Aktivität von(23207 ± 5220)/(14,56 ± 0,35) = 1594 ± 361 Units/mg Protein.4.1.1.3 Synthese von 9S-Hydroperoxyoctadeca-10(E),12(Z)-diensäure mit dem isoliertenEnzymextrakt100 mg (0,36 mmol) Linolsäure wurden in 5 ml einer wäßrigen 0,01 %-igen Tween 20-Lösung durch Zugabe von 2 ml 1 N NaOH gelöst. Nach Verdünnen mit Boratpuffer(20 mmol/l; pH 9,5) auf 250 ml wurde mit verdünnter Salzsäure auf pH 9,5 angesäuert. DieLösung wurde daraufhin gekühlt und während dieser Zeit durch Einleiten von Sauerstoff mitSauerstoff gesättigt. Nach Zugabe von 10 ml des isolierten Enzymextraktes zu der Substratlösungwurde bei 0 °C weiterhin Sauerstoff durch den Reaktionsansatz geleitet. DerVersuchsverlauf wurde mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie kontrolliert [Hexan/Ethylacetat80/20; R f (Produkt) = 0,17-0,2].Der Versuch wurde nach acht Stunden durch Ansäuern der Reaktionslösung mit 2 N HCl aufpH 3 abgebrochen, obwohl zu diesem Zeitpunkt noch keine vollständige Umsetzung erfolgtwar, wie die spätere NMR-Untersuchung ergab. Die angesäuerte Lösung wurde dreimal mit100 ml Diethylether extrahiert. Die etherischen Phasen wurden vereinigt, zweimal mit je75 ml Wasser gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittelwurde am Rotationsverdampfer entfernt.Es wurden etwa 90 mg eines Gemisches von Linolsäure und 9S-Hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadiensäure erhalten. Der Peroxidgehalt betrug ca. 60 % (NMR-Auswertung).