Dissertation Klaus Heitkamp 1999

98 4 Ergebnisse und Diskussionbluten trat nur bei Reaktoren mit frischem Immobilisat auf, wenn diese in das 2-Pumpen-HPLC-System eingebaut und mit alkalischem Boratpuffer (pH 10) durchspült wurden. BeimSpülen der Reaktoren mit Methanol, Wasser oder Phosphatpuffer (pH 7) konnte einAusbluten nicht festgestellt werden. Die Ursache lag vermutlich in einem Auswaschenrestlicher, nur adsorptiv gebundener Mikroperoxidase, die durch einfaches Waschen derBeads nach der Immobilisierung nicht entfernt werden konnte. Darüber hinaus ist auch eineteilweise Hydrolyse der bei der Immobilisierung entstehenden Amidbindung zwischenCarboxyl-Gruppen der Mikroperoxidase und Aminogruppen des Trägers möglich (Abbildung47). Diese Reaktion läuft unter basischen Bedingungen ab, wie sie auch bei Verwendung desBoratpuffers (pH 10) als Reagenzienlösungmittel vorliegen.EnzymONHCPGOHEnzymOOHNHCPGH 2OEnzymOO+CPG NH 2Abbildung 47Basenkatalysierte Hydrolyse der zur Immobilisierung genutzten SäureamidbildungTrotz des beobachteten Auswaschens war aber auch nach sehr langer, intensiver Nutzung derReaktoren (ca. 300 Injektionen, entspr. ca. 6000 Minuten) immer noch eine hohe Peroxidaseaktivitätfeststellbar.Um gegebenenfalls die Standzeit der Reaktoren weiter zu erhöhen, wurde versucht, eineLösung von 4-Hydroxyphenylessigsäure in Phosphatpuffer pH 7 als Reagenz einzusetzen.Wie eigene und auch frühere Untersuchungen 11,109 ergaben, war es unter diesen Bedingungenjedoch zwingend notwendig, im HPLC-System hinter dem Reaktor den pH-Wert des Eluatesdurch Zugabe von Natronlauge anzuheben. Nur unter diesen Bedingungen zeigte das aus4-Hydroxyphenylessigsäure gebildete Dimer eine starke Fluoreszenz (siehe Abbildung 18).Es wurde deshalb auf das von Heinmöller 11 beschriebene 3-Pumpen-System zurückgegriffen,bei dem nach erfolgter Reaktion von Hydroperoxid, Peroxidase und PES zusätzlichNatronlauge zudosiert wird. Dieses System wurde für den Einsatz der Enzymreaktoren entsprechendmodifiziert (Kapitel 6.6.6). Die Konzentration und die Flußrate der PES-Lösungwurden beibehalten.