Dissertation Klaus Heitkamp 1999

32 4 Ergebnisse und Diskussion4 Ergebnisse und Diskussion4.1 Synthese von ReferenzsubstanzenDie Verfügbarkeit von Referenzsubstanzen ist bei der chromatographischen Untersuchungvon Probenmaterialien unbedingt erforderlich, um eine eindeutige Identifizierung der Probenbestandteilezu gewährleisten.4.1.1 Gewinnung von 9-Lipoxidase aus Kartoffeln; Synthese von 9-HydroperoxyoctadecadiensäureIsomerenreine Lipidhydroperoxide lassen sich, wie bereits erläutert, nur über eine enzymatischeOxidation der Fettsäuren herstellen. So gelangt man mit Hilfe der leicht verfügbarenSojabohnen-Lipoxidase schnell und einfach zu den 13S-Hydroperoxyderivaten der Linol- undLinolensäure. Die zur Synthese anderer isomerer Hydroperoxide notwendigen Lipoxidasensind jedoch nicht ohne weiteres käuflich zu erwerben. Es wurde deshalb die Praktikabilitäteiner Enzymisolierung zur Synthese größerer Mengen von 9S-Hydroperoxydecadiensäurebzw. -triensäure untersucht. In Anlehnung an ein von Reddanna et al. beschriebenesVerfahren 27 wurde versucht, das erforderliche Enzym aus Kartoffeln zu isolieren. DieVersuche dazu fanden am Institut für Biochemische Pflanzenpathologie der GSF in Münchenstatt.4.1.1.1 EnzymisolierungGewaschene Kartoffeln (Hansa; 500 g) wurden bei 4 °C mit 1000 ml Pufferlösung(Phosphatpuffer 100 mmol/l pH 6,3; Natriummetabisulfit 2 mmol/l; Ascorbinsäure 2 mmol/l;EDTA 1 mmol/l) versetzt und homogenisiert. Nach Filtration des Homogenisates durch zweiLagen Leinentuch wurde 20 Minuten bei 10000 g zentrifugiert. Das sedimentierte Pelletwurde verworfen und die überstehende Flüssigkeit zur Peptidfällung (Enzymfällung) benutzt.Dazu wurde die Flüssigkeit bis zu einer 15 %-igen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetztund der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Ammoniaklösung auf 6,3 eingestellt. AusgefallenesProtein, welches das gewünschte Enzym enthalten sollte, wurde durch15-minütiges Zentrifugieren bei 15000 g abgetrennt. Der Überstand wurde erneut mit Ammo-