Dissertation Klaus Heitkamp 1999

126 5 Zusammenfassung und Ausblick5 Zusammenfassung und AusblickZur Entwicklung von Detektionssystemen für die HPLC-Bestimmung der biologisch relevantenLipidhydroperoxide ist es nötig, entsprechende Referenzsubstanzen einzusetzen. Ausdiesem Grunde wurden in dieser Arbeit zunächst verschiedene isomerenreine Hydroperoxyfettsäurenund Hydroperoxyfettsäureester, aber auch Gemische isomerer Hydroperoxyfettsäuremethylestersynthetisiert. Dabei konnte in der Regel auf frühere Arbeiten zurückgegriffenwerden. Einzelne Syntheseschritte wurden jedoch wesentlich verbessert. So wurde dieVerseifung geschützter Fettsäureester enzymkatalysiert durchgeführt und bei der photosensibilisiertenOxidation statt einer Hg-Hochdrucklampe eine Halogenlampe eingesetzt. Dadurchkonnte der Anteil an Nebenprodukten, die sich in früheren Arbeiten als störend erwiesen,stark gesenkt werden. Die Identifizierung der synthetisierten Verbindungen erfolgtehauptsächlich durch die 1 H- und die 13 C-NMR-Spektroskopie. Die massenspektrometrischeAnalyse der gewonnenen Referenzsubstanzen erwies sich hingegen als wenig aussagekräftig.Die synthetisierten Verbindungen dienten als Standards für die Entwicklung einer photometrischenTestmethode für Lipidhydroperoxide auf der Basis von N,N,N´,N´-Tetramethyl-1,4-phenylendiamin. Die mit diesem Test erreichten Nachweisgrenzen entsprachen denenbekannter photometrischer Verfahren (FOX2-Test; Messung der I - 3 -Absorption). In diesemZusammenhang wurde erneut und im Einklang mit der entsprechenden Literatur festgestellt,daß der oft benutzte TBA-Test (Umsetzung von Aldehyden aus dem Zerfall von Lipidhydroperoxidenmit Thiobarbitursäure zu gefärbten Produkten) eine quantitative Aussage überden Oxidationsgrad von Öl- bzw. Fettproben nicht zuläßt.Die synthesebegleitende Analytik erfolgte bei der photosensibilisierten Oxidation von Fettsäuremethylesternmit 1 O 2 zu den entsprechenden Hydroperoxiden durch die HPLC-Trennungder Reaktionsprodukte an Normalphasen. Sie stellte sich dabei als eine leistungsfähigeMethode zur Trennung isomerer Hydroperoxyfettsäuremethylester dar. Allerdings sind aufdiesem Gebiet noch weitere Untersuchungen nötig, insbesondere zum Einfluß anderer Eluentensystemeauf die Trennung, um gegebenenfalls die Trennleistung weiter zu verbessern. Eingroßer Nachteil der HPLC-Trennung an Normalphasen ist das Fehlen einfacher, für Lipidhydroperoxideselektiver Nachweismethoden. Aus diesem Grunde wurde ein Verfahren zurNachsäulenderivatisierung von Hydroperoxiden und anschließender UV/VIS-Detektion in derNP-HPLC auf Grundlage der Oxidation des farblosen 1,5-Diphenylcarbohydrazid zum roten1,5-Diphenylcarbazon entwickelt. Zur Optimierung des Nachsäulenderivatisierungssystemswurde in dieser Arbeit das Verfahren der sogenannten "linearen statistischen Optimierung"