JGW-SchülerAkademie Papenburg 2011 - Jugendbildung in ...

2.10 Versuch: Quantifizierung der Aktivität der Beta-Galactosidase
schockgefroren. Dieser Teil des Versuches wurde in einem Labor vorbereitet; die im
Folgenden beschriebenen Schritte wurden im Kurs durchgeführt.
Zuerst wurden die Zellpellets in 1 ml Z-Puffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4,
10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,0) resuspendiert und pro
Versuchsansatz (die Kulturen wurden in vier Teile aufgeteilt – ein Teil davon diente
als Referenzwert für die spätere photometrische Messung) 100 µl Zellsuspension mit
700 µl Z-Puffer verdünnt. Um die Zellen aufzubrechen, wurden daraufhin jeweils 20 µl
Chloroform und 20 µl 0,1 % (w/v) SDS zugegeben. Zum Starten der Nachweisreaktion
wurde zu den Ansätzen 200 µl 4 mg/ml ONPG hinzugefügt. Sobald ein Farbumschlag ins
Gelbe stattgefunden hatte, wurde die Reaktion durch Zugabe von 400 µl 1M Natriumcarbonat,
das jegliche Enzymaktivität durch Verschiebung des pH-Werts ins Basische
unterbindet, gestoppt und die Reaktionszeit gemessen. Für die Kontrollversuche wurde
das Natriumcarbonat vor dem ONPG hinzugefügt, damit keine Reaktion stattfindet und
man einen Vergleichswert für die photometrische Messung erhält. Um präzise Ergebnisse
zu erhalten, wurden Dreifachbestimmungen für die verschiedenen Kulturen und
Zeitpunkte durchgeführt. Dazu wurde jeweils mit 1 ml des abgestoppten Reaktionsansatzes
bei 420 nm am Photometer die Absorption gemessen; die Kontrollversuche dienten
dabei als Referenzwerte. Die β-Galactosidase-Aktivität (in Miller-Units) wurde dann mit
folgender Formel ermittelt:
MU = 1000A420
OD600 · V · t
(V = Volumen des Reaktionsansatzes in mL, t = Reaktionszeit in min)
2.10.3 Ergebnisse
Bei den Versuchsansätzen, die nur Lactose enthielten, zeigte sich die größte Enzymaktivität.
Es war deutlich zu erkennen, dass die Enzymaktivität steigt, je länger die Kultur
auf dem Nährmedium mit dem Zucker wachsen konnte. Dies ist darauf zurückzuführen,
dass in einer längeren Zeitspanne eine größere Enzymmenge produziert werden kann.
In den Versuchsansätzen, die sowohl Lactose als auch Glucose enthielten, zeigte sich eine
deutlich geringere Enzymaktivität. Auch hier war eine Abhängigkeit der Enzymaktivität
von der Wachstumszeit der Bakterienkultur zu erkennen. In den Proben mit Lactose
und Chloramphenicol ließ sich keine Enzymaktivität feststellen. Ferner war auch bei
den Kontrollversuchen, die die jeweiligen Referenzwerte lieferten, keine Enzymaktivität
nachzuweisen, weil der pH-Wert durch die frühzeitige Zugabe des Natriumcarbonats so
stark erhöht wurde, dass die Enzyme denaturiert wurden.
2.10.4 Diskussion
Insgesamt zeigte der Versuch, dass die β-Galactosidase-Aktivität reguliert wird und
ihre Aktivität sowohl vom vorhandenen Zucker als auch von der Wachstumszeit der
Zellkultur auf dem Nährmedium abhängt. So ist wie erwartet bei den Ansätzen mit
Glucose und Chloramphenicol wenig bis gar keine β-Galactosidase nachzuweisen, da
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