Sak 03807 O Vedlegg Fagleg Rapportering 2006 - Helse Vest

367Forskningsprosjekt 911006:Fosfoprotein-proteomikk for identifikasjon av nyebehandlingsmålProsjektansvarlig: Kari Espolin Fladmark (kari.fladmark@pki.uib.no), Universitetet i BergenFlt3 transmembran reseptor-tyrosinkinase benyttes som modell for feilregulertproteinfosforylering i blodkrefttypen akutt myelogen leukemi (AML). Hele 30 % avpasientene har mutasjoner i Flt3 som er forbundet med dårlig prognose.Mutasjoner i Flt3 er enten lengdemutasjoner (ITD) i det intracellulære området rett undercellemembranen, eller mutasjoner i kinasesetet. Mutasjonene fører til at kinasen blir hyperaktiv, dvsuavhengig av Flt3-ligand for å stimuleres. Hos pasienter ved Haukeland Universitetssykehus finner vien stor variasjon i både lengden og sekvensområdet til Flt3-ITD. For å undersøke hvorvidt de ulikeITD mutasjonene gir forskjeller i cellesignalisering, har vi kjørt prøver fra pasienter på RNAekspresjonsmatriser. Vi finner flere interessante endringer i signalveiene på RNA-nivå som har vist segå korrelere til proteinstudier.Vi ønsker å benytte proteinanalysemetoder (proteomikk) til å finne feilregulerte proteiner dafremtidens målrettede behandling går ut på å hemme spesifikke signalveier. Aktiverer celler medmutert Flt3 andre signalveier enn celler med normal Flt3? Normal Flt3 og Flt3-konstrukter basert påmutasjonene i pasientmaterialet gir høy ekspresjonseffektivitet når uttrykt fra ekspresjonsvektoren.Ved transfeksjon med normal Flt3 av ulike adherente cellelinjer, viser det seg at cellene begynner åmiste taket og dø. Dette er overraskende da Flt3 i følge litteraturen fremmer overlevelse, men aktuellforskning viser også at kreftfremkallende proteiner (onkoproteiner) i enkelte situasjoner kan fremkallecelledød (apoptose). Ved bruk av etablerte metoder har vi likevel ikke klart å påvise apoptose. Vi vilderfor gjøre proteomikk på de transfekterte cellene i tidsrommet før de dør av Flt3 uttrykket.Proteiner som binder til reseptorer etter ligandstimulering binder ofte til fosforylerte aminosyrer ogofte i det tilsvarende området som ITDene er lokalisert. Aktuelle aminosyrer i dette området har blitt”slått ut”. Vi detekterer forskjellige proteinfosforyleringsmønstere mellom de ulike mutantene og eninteressant observasjon er at ett av de mutante proteinene fører til ytterligere økt celledød. Vibenytter SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) til å identifisere Flt3bindingspartnere og nedstrøms signalproteiner. SILAC er en kvantitativ proteomikkmetode sommuliggjør sammenligning av proteinekspressjon/ fosforylering mellom opptil 3 ulike cellekondisjonervha isotopermerking og peptidanalyse med LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry).Mekanismen for Flt3 reseptorinternalisering kan fortelle noe om rollen til Flt3 i AML. Vi har utført etSILAC-forsøk hvor en cellelinje som uttrykker normal Flt3 ble langtids-stimulert med Flt3-ligand, noesom medfører nedregulering av reseptoren. Vi har identifisert omtrent 700 SILAC-proteiner vha LC-MS. Ulike bioinformatikkverktøy ble benyttet for å behandle de store datamengdene, og det viste segat kun et fåtall av de identifiserte proteinene var opp/ned-regulerte etter langtids-stimuleringen. Disseverifiseres nå ved hjelp av Western blot.SILAC benyttes nå til å undersøke proteiner som er feilregulerte som et resultat av ulike mutasjoner iFlt3. For å benytte SILAC spesifikt til fosfopeptider, tar vi i bruk bestemte fosfopeptidanrikendekolonner og 2 dimensjonell kapilær LC–MS. Det er nå utviklet gode metoder for LC basertproteinfraksjonering på PROBE som vil gjøre det lettere å finne identiteten på fosfoproteiner i enkompleks proteinblanding.3 vitenskapelige artikler er publisert i 2006:Irish JM, Anensen N, Hovland R, Skavland J, Borresen-Dale AL, Bruserud O, Nolan GP, Gjertsen BT"Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression are detected in acute myeloidleukemia cells with high levels of phosphorylated wild-type p53."Blood. 2006PMID: 17105820Solstad T, Fladmark KE"Algal toxins as guidance to identify phosphoproteins with key roles in apoptoticTranslasjonsforskning - Oncogenesis & Cancer Research